DB21T 1861.3-2010 水产生物种质检验技术规程 简单重复序列间区扩增法.pdf

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1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.3—2010水产生物种质检验技术规程简单重复序列间区扩增法ISSRproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.3—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，

2、李宏俊，鲍相渤。IDB21/T1861.3—2010水产生物种质检验技术规程简单重复序列间区扩增法1范围本标准规定了水产生物简单重复序列间区扩增法（ISSR）的原理、试剂和材料、仪器、采样、分析步骤、数据分析和结果分析。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT18654.15-2008养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3术语和定义下列术语和定义适用于本标准

3、。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。www.bzfxw.com3.2遗传多样性（geneticdiversity）所有生物携带的遗传信息的总和。广义上是指种内或种间，表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度，狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。本标准采用其狭义概念。3.3等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中

4、一个基因可能有许多等位基因。3.4等位基因频率（allelefrequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.5遗传杂合度（heterozygosity）表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.6平均遗传杂合度（averageheterozygosity）表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.7多态信息含量（PIC）表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.81DB21/T1861.3—2010遗传距离（geneticdistance）用基因频率的

5、函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。4原理简单重复序列间区扩增法inter-simplesequencerepeat(ISSR)的基本原理是利用简单重复序列设计引物，即引物主要由1~4个碱基组成的重复序列，通常在引物的3'端或5'端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因组DNA中的SSR的3′或5′端结合。在PCR反应中，

6、锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。5试剂和材料5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA7.44g，加超纯水到1L。5.6冰乙酸：分析纯。www.bzfxw.com5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9蛋白酶K（20mg/mL）：生化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.1

7、3硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16TaqDNA聚合酶（生化试剂，5U/L）。5.17标准分子量Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）。5.2120%凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g，20×TBE缓冲液10mL，加超纯水到200mL。5.22上样缓冲液：98％甲酰胺，10mMEDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。5.230.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g硫代硫酸钠（Na

8、2S2O3•5H2O）溶于100ml超纯水中。5.24银染液：1g硝酸银溶于1L