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时间:2018-12-14
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1、实用标准文案[收稿日期][基金项目]无[作者简介]肖贵榜(1970—),男,讲师,在读硕士,研究方向:鱼类生物化学与分子生物学.黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化肖贵榜1,2葛正龙2张艳磊2李作祥3(1.遵义职业技术学院,贵州遵义563000;2.遵义医学院生物化学与分子生物学教研室,贵州遵义563003;3.贵阳职业技术学院生物化学工程系,贵州贵阳550081)[摘要]用差速离心法和改进的碱裂解法分离纯化遵义小钝吻鮠(LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.)线粒
2、体DNA,紫外检测其OD260/OD280在1.78~1.85之间,并计算出该鱼肝组织线粒体DNA的含量为0.613μg/g。纯化样品经紫外分析仪在200nm~290nm波长范围内扫描,呈现典型的DNA吸收峰,其最大吸收峰在259.0nm~260nm之间。以λDNA/HindⅢ的完全酶切片段作为相对分子量标准,利用电泳迁移率与分子量的对数的线性关系,由已知片段大小推算出遵义小钝吻鮠mtDNA分子大小为15.44(±0.16)Kb。[关键词];线粒体DNA;分离纯化;鮠属;鱼类[中图分类号][文献标识码]A鱼类居于脊椎动物中较原始的地位
3、,但其种类繁多,数量极其庞大[1]。鱼类为人类提供了质量极佳的蛋白质营养。人们对鱼类的研究已极为广泛,在遗传方面,传统的形态标记、细胞学标记和同工酶分析等已成功地应用于多种鱼类的种群识别[2][3]。鱼类mtDNA为共价闭环的双链DNA,分子大小15561~18705bp之间[4],是鱼类唯一核外遗传物质,具有基因组结构简单,进化速度快,母系遗传和在世代传递过程中不发生重组等特性,自上世纪80年代以来成为群体遗传分化和追溯母系起源的一个良好模型。由于上述特点,以mtDNA作为分子标记,探讨鱼类的群体遗传结构与系统演化,已成为鱼类分子群
4、体遗传学和系统学研究中的热点。遵义小钝吻鮠(LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.)[5]隶属于鲇形目鲿科鮠属,黔北最为名贵的野生经济鱼类之一,在当地颇受人们青睐。为了进一步研究其在分类上的地位及其和相近种属鱼类的亲缘关系,我们首次提取了该鱼线粒体DNA,以期为后续研究工作提供科学依据和基础资料。1材料与方法:1.1试验材料试验用鱼为黔北洛安江一野生鮠属新种遵义小钝吻鮠(LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.)。鱼体
5、长80.26mm~120.96mm(95.6±9.692),体重20g~35g(25±2.5)。所有试验用鱼活体充氧后快速运回实验室后置水族箱经纯净水暂养三日备用。取肝前去血。1.2试验方法1.2.1准备工作所用剪刀、镊子、容器、离心管、枪头等洗净、烘干灭菌备用①试剂配制:鱼用生理盐水:为Burnstock生理盐水[6],需预冷。STE:10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MNaCl1mMNa2EDTA(pH8.0)蒸汽高压灭菌后保存于4℃备用。SE:0.25M蔗糖精彩文档实用标准文案30mMTris-Cl(pH8.0)10mM
6、Na2EDTA2.5mMCaCl2CaCl2应配成的贮存浓度,且须过滤除菌保存于4℃备用。TEN(10XTEN):0.1MTris-Cl(pH8.0)0.01MEDTA(pH8.0)1MNaCl1%SDS含0.2MNaoH(用20%SDS和10MNaoH新鲜配制。)KAc应用液:60mL5MKAc溶液、11.5mL冰醋酸、28.5mL蒸馏水。应先配制5MKAc贮存液低温保存备用。氯仿:异戊醇:体积比为24:1。除20%SDS无需灭菌,NaoH用塑料容器室温保存外,其余试剂(包括贮存液)最好灭菌置低温环境保存。另需准备Tris饱和酚(北
7、京索莱宝),无水乙醇。②冰浴环境:在不漏水隔热箱内置入经-20℃保存10小时以上的冰袋,并加入适量的0—4℃的干净冰水,最终使其内部温度保持在4℃以下的冰盒.通常准备两个较大冰盒。预冷解剖用具。将剪刀、镊子、小烧杯及各种离心管预冷。预冷玻璃匀浆器,并向玻璃匀浆器玻棒内注入0—4℃干净冰水,匀浆器装配好后置入冰浴中预冷。使用电动匀浆需准备预冷的50ml离心管。③提前15min启动Eppendorf高速冷冻离心机。水平放置电子天平并调零。1.2.2肝脏线粒体提取步骤①将去血后的鱼体由鳃后腹部左右两侧解剖鱼体取肝。小心移去胆囊后剔除结缔组织
8、。肝脏称重后置冰冷小烧杯中用鱼用生理盐水冲洗,经STE漂洗3次,剪碎后按重量与体积之比1:8移取SE用玻璃匀浆器匀浆或电动匀浆;②匀浆液转入2mlEppendorf管以2℃,3000r/min离心10min;弃沉淀,小心
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