黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体dna的分离纯化定稿

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1、[收稿日期][基金项目]无[作者简介]肖贵榜（1970—），男，讲师，在读硕士，研究方向：鱼类生物化学与分子生物学.黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化肖贵榜1，2葛正龙2张艳磊2李作祥3（1.遵义职业技术学院，贵州遵义563000；2.遵义医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义563003；3．贵阳职业技术学院生物化学工程系，贵州贵阳550081）[摘要]用差速离心法和改进的碱裂解法分离纯化遵义小钝吻鮠（LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.）线粒体DNA,紫外检测其OD260/OD280在

2、1.78～1.85之间，并计算出该鱼肝组织线粒体DNA的含量为0.613μg／g。纯化样品经紫外分析仪在200nm～290nm波长范围内扫描，呈现典型的DNA吸收峰,其最大吸收峰在259.0nm～260nm之间。以λDNA／HindⅢ的完全酶切片段作为相对分子量标准，利用电泳迁移率与分子量的对数的线性关系,由已知片段大小推算出遵义小钝吻鮠mtDNA分子大小为15.44(±0.16）Kb。[关键词]；线粒体DNA；分离纯化；鮠属；鱼类[中图分类号][文献标识码]A鱼类居于脊椎动物中较原始的地位，但其种类繁多，数量极其庞大[1]。鱼类为人类提供了质量极佳的蛋白质营养。人

3、们对鱼类的研究已极为广泛，在遗传方面，传统的形态标记、细胞学标记和同工酶分析等已成功地应用于多种鱼类的种群识别[2][3]。鱼类mtDNA为共价闭环的双链DNA,分子大小15561~18705bp之间[4]，是鱼类唯一核外遗传物质，具有基因组结构简单，进化速度快，母系遗传和在世代传递过程中不发生重组等特性，自上世纪80年代以来成为群体遗传分化和追溯母系起源的一个良好模型。由于上述特点，以mtDNA作为分子标记，探讨鱼类的群体遗传结构与系统演化，已成为鱼类分子群体遗传学和系统学研究中的热点。遵义小钝吻鮠（LeioxassismicrocrassirostrisZuny

4、iensisXiaosp.nov.）[5]隶属于鲇形目鲿科鮠属，黔北最为名贵的野生经济鱼类之一，在当地颇受人们青睐。为了进一步研究其在分类上的地位及其和相近种属鱼类的亲缘关系，我们首次提取了该鱼线粒体DNA，以期为后续研究工作提供科学依据和基础资料。1材料与方法：1.1试验材料试验用鱼为黔北洛安江一野生鮠属新种遵义小钝吻鮠（LeioxassismicrocrassirostrisZunyiensisXiaosp.nov.）。鱼体长80.26mm～120.96mm(95.6±9.692)，体重20g～35g(25±2.5)。所有试验用鱼活体充氧后快速运回实验室后置水族

5、箱经纯净水暂养三日备用。取肝前去血。1.2试验方法1.2.1准备工作所用剪刀、镊子、容器、离心管、枪头等洗净、烘干灭菌备用①试剂配制:鱼用生理盐水：为Burnstock生理盐水[6]，需预冷。STE:10mMTris-Cl(pH8.0)0.1MNaCl1mMNa2EDTA(pH8.0)蒸汽高压灭菌后保存于4℃备用。SE：0.25M蔗糖30mMTris-Cl(pH8.0)10mMNa2EDTA2.5mMCaCl2CaCl2应配成的贮存浓度，且须过滤除菌保存于4℃备用。TEN（10XTEN）：0.1MTris-Cl(pH8.0)0.01MEDTA(pH8.0)1MNaC

6、l1%SDS含0.2MNaoH(用20%SDS和10MNaoH新鲜配制。)KAc应用液：60mL5MKAc溶液、11．5mL冰醋酸、28．5mL蒸馏水。应先配制5MKAc贮存液低温保存备用。氯仿：异戊醇：体积比为24:1。除20%SDS无需灭菌，NaoH用塑料容器室温保存外，其余试剂（包括贮存液）最好灭菌置低温环境保存。另需准备Tris饱和酚（北京索莱宝），无水乙醇。②冰浴环境：在不漏水隔热箱内置入经-20℃保存10小时以上的冰袋，并加入适量的0—4℃的干净冰水，最终使其内部温度保持在4℃以下的冰盒.通常准备两个较大冰盒。预冷解剖用具。将剪刀、镊子、小烧杯及各种离心

7、管预冷。预冷玻璃匀浆器，并向玻璃匀浆器玻棒内注入0—4℃干净冰水，匀浆器装配好后置入冰浴中预冷。使用电动匀浆需准备预冷的50ml离心管。③提前15min启动Eppendorf高速冷冻离心机。水平放置电子天平并调零。1.2.2肝脏线粒体提取步骤①将去血后的鱼体由鳃后腹部左右两侧解剖鱼体取肝。小心移去胆囊后剔除结缔组织。肝脏称重后置冰冷小烧杯中用鱼用生理盐水冲洗，经STE漂洗3次，剪碎后按重量与体积之比1：8移取SE用玻璃匀浆器匀浆或电动匀浆；②匀浆液转入2mlEppendorf管以2℃，3000r/min离心10min；弃沉淀，小心将上清液转移至预冷的1.5mLE