大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为肝样细胞的实验研究-外科学专业毕业论文

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1、学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。作者签名：日期：啦幽学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印

2、、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密作者签名：日期：进勘导师签名：日期：趁竺星二￡，，握大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其分化为肝样细胞的实验研究中文摘要目的建立骨髓间充质干细胞(bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,BM．MSCs)体外分离纯化的方法，探讨联合应用肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)和粒细胞集落刺激因子(granulocytec

3、olonystimulatingfactor,G．CSF)诱导BM．MSCs分化为肝样细胞的可行性。方法1、BM．MSCs分离、纯化：无菌条件下抽取2周龄SPF级SD大鼠股骨和胫骨的骨髓细胞，根据BM．MSCs与其他细胞贴壁性的差异，通过换液、传代达到分离纯化细胞目的；2、BM-MSCs的鉴定：从细胞贴壁性、免疫表型检测(CDl4、CD34、CD90)及分化为脂肪细胞三方面进行细胞；3、BM-MSCs向肝样细胞分化：(1)实验分组：①Go组：不添加任何因子，设立阴性对照；②Gl组：20ng／mlHGF，阳性对照组；③G2：20n

4、g／mlHGF+5ng／mlG-CSF：④G3组：20ng／nllHGF+10ng／mlG-CSF；⑤G4组：20ng／mlHGF+20ng／miG-CSF：(2)诱导分化：取P5细胞，待其90％融合后，胰酶消化，调整细胞密度为2x105／ml，按实验分组接种于6孔板中，每隔3天换液一次；(3)肝样细胞鉴定：①细胞功能检测：选取诱导第7、14天的细胞进行PAS染色，检测糖原合成、分泌情况；②细胞标记物检测：选取诱导第7、14、21天的细胞，提取RNA，RT-PCR半定量检测AFPmRNA和ALBmRNA的表达水平。4、统计学数据

5、均用均数4-标准差(i士s)表示，采用SPSSl3．0软件处理，方法是单因素方差分析和g检验法，检验标准a=O．05。结果1、获得高活力的均质BM．MSCs，细胞呈梭型，辐射状、涡旋状分布，台盼蓝拒染活细胞计数法显示，细胞存活率可达95％以上；2、链霉亲和素．生物素．过氧化物酶复合物(SABC法)检测显示，细胞阳性表达CD90(阳性染色率96％,-97．2％)，造血祖细胞和内皮细胞标记物CD34和巨噬细胞和单核细胞显著表达的CDl4，几乎不表达(阳性染色率<1．5％)，说明获得细胞中几乎不包含以上几种常见的混杂细胞，BM．MSC

6、s纯度高。3、在成脂条件培养基诱导下，细胞第5日即有脂肪滴形成，脂滴逐渐增大、融合，油红O染色后，脂肪被染成橙红色，提示阳性染色；4、Gl如组条件培养基诱导后，部分细胞死亡、脱落，存活细胞的胞体逐渐回缩成圆形或多角形，贴壁能力减弱，扩增速度减慢，局部出现群聚，以G3、G4明显。G0阴性对照组的细胞形态未见明显变化；5、Gl如组诱导第7、14天的细胞PAS染色，均见胞浆红染颗粒，Go对照组未见阳性染色；同一时间点，G1．4组间阳性染色率差异有统计学意义(户．<0．05)，其中Gl与G2，G3与G4比较，差异均无统计学意义(P>o．

7、05)，阳性染色率差异不明显；G3、G4与G2比较，差异有统计学意义(P<0．05)，G3、G4组阳性染色率较高。以上结果提示：G1．4几种方案诱导后的细胞均能合成、分泌糖原，联合应用HGF和GCSF诱导后的细胞糖原染色率较高，其中G-CSF的适宜浓度为10ng／ml，G-CSF浓度提高到20ng／na并不能提高PAS阳性染色率，低浓度的G-CSF(5ng／m1)也不能发挥其联合诱导中的协同作用；6、RT-PCR测定诱导后的细胞AFP、ALB的mRNA表达水平，G1．G4组中，BM．MSCs在诱导第7天均表达AFP，14天表达降

8、低，2l天测得AFP无表达；ALB在第14天出现表达，2l天表达增多，Go阴性对照组始终无AFP或ALB表达。目的基因表达水平中，G¨组各时间点的AFP灰度比值组内差异均有统计学意义(p∞．05)，呈下降趋势；G1．4实验组，各时间点的ALB灰度比值组内差异均有