表(二)任务书(阳启顺).doc

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1、昆明学院2014届毕业论文（设计）任务书论文（设计）题目光照对拟南芥抗灰霉菌分泌毒素的影响子课题题目论文（设计）期限2014年02月25日至05月17日（共12周）姓名阳启顺学号201014010220所属院系生命科学与技术系专业班级10级生物科学2班指导教师杨红玉教授教务处编论文（设计）课题来源论文（设计）课题类型国家自然科学基金实验研究类本论文（设计）的目的和要求（包括教师应给出的设计原始资料）灰霉菌（Botrytiscinerea）引起世界范围内多种重要经济作物病害，特别是温室及大棚内的高温高湿

2、环境，很适合灰霉菌生长繁殖，因此灰霉菌被认为是对温室花卉、大棚蔬菜和育苗期经济作物危害最大的病原体之一。灰霉菌在植物贮运中继续繁殖侵染，因此，它不仅造成农作物收成前的经济损失，而且导致收成后的重大经济损失。现在已知的灰霉菌蛋白有两种，即对植物生长具有抑制作用的毒素蛋白和对植物生长具有促进作用的激活蛋白。植物病原真菌毒素是病原物产生的次生代谢物，为病原物与植物间互作识别过程中的产物，往往在植物病程发展中起着重要作用。激活蛋白能诱导多种植物产生一系列的系统抗性，能促进植物生长，改善作物品质。因此，本课题目

3、的在于通过将灰霉菌大分子毒素渗入到拟南芥叶片中，设置光照、黑暗为对照实验，统计病情指数，利用统计学分析结果，进一步探索光照对拟南芥抗灰霉菌分泌毒素的影响，进而为研究灰霉菌的致病机制作出铺垫。在做实验之前，必须要把每一个步骤弄清楚，特别是在测定粗蛋白含量时，应详尽各个试剂的量，在避免浪费的同时又注重实验的效率。学生应完成的任务（包括设计计算说明书、图纸等）一、制定实验方案1.查阅相关文献资料；2.配制所需溶液.3.准备所需的实验材料和仪器设备二、实验实施方案1.拟南芥和灰霉菌的培养（1）拟南芥的培养取适

4、量的拟南芥种子于1.5ml的离心管中，加入1ml无菌水浸泡30分钟，然后分别用1ml95%酒精和0.1%HgCl消毒5分钟，无菌水洗涤5次。然后将消毒好的种子均匀散到灭过菌的MS培养基上，封口膜封口，标上日期，放到4度冰箱春化2天。将培养皿置于光照培养箱中（12h光照，22°C）培养直到长出2片真叶时将幼苗移栽到装有灭菌腐殖土的小花盆中，花盆放在托盘中，托盘内盛有水，用保鲜膜覆盖小花盆4天后揭开保鲜膜。温度保持在22度左右，光照时间为12小时。（2）灰霉菌的培养将灰霉菌菌种接到马铃薯培养基中22℃，黑

5、暗，倒置培养10天，将马铃薯培养基上生长的灰霉菌接种于装有马铃薯培养液的三角瓶中，用棉塞封口置于180转/分振荡恒温培养箱中培养5天，温度保持在25-28℃。2.灰霉菌分泌的大分子毒素的提取将三角瓶中的培养液于4℃，5000r/min离心15分钟，收集上清液，用布氏漏斗、真空水循环泵和定性滤纸（快、中、慢各一次）抽滤上清液，滤出液-80℃冷冻干燥，然后用无菌水溶解，溶解液在4℃灭菌水中透析2天，其中每8h换一次水，截留分子量大于14,000Da的大分子物质,透析袋里的即为大分子毒素。透析袋里粗蛋白含量

6、仍然很低，进而选择冷冻干燥，将粗蛋白进一步提纯。3.灰霉大分子毒素蛋白含量的鉴定紫外光吸收法：由于多数蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等苯环结构的氨基酸，而这些氨基酸在紫外光280nm有最大吸收高峰，吸收值与蛋白质的含量成正比，所以采用280nm紫外吸收法测定蛋白质含量。样品蛋白含量测定：取样品适量，在280nm下以蒸馏水为对照测定其吸光度值，然后根据已制作完成的标准曲线，计算出粗毒素中蛋白质含量。Bradford法：G-250(Coomassiebirlliantblue,G-250)有红、

7、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465～595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比。首先用牛血清蛋白在595nm下制作标准曲线，再在280nm下测出粗蛋白吸光度值，根据标准曲线计算出粗蛋白浓度。4.将已知浓度的粗蛋白配制成200μg/ml、500μg/ml，每片叶子渗入10ml。观察、记录病情指数，并进行统计学分析。设置对照实验，分组如下表：条件渗入粗毒素（叶片数）渗入蒸馏水

8、（叶片数）渗入牛血清蛋白（叶片数）光照2055黑暗2055三、进行实验结果分析四、按照昆明学院毕业论文要求，撰写和修改毕业论文五、毕业论文答辩论文（设计）各部分内容和时间分配（可根据具体时间安排添加）第1~1周：查阅相关文献，撰写开题报告第2~8周：进行实验，获得实验结果并分析结果第9~10周：毕业论文的撰写、修改和定稿第11~11周：毕业论文答辩参考文献（教师指定学生阅读的参考文献，不少于5篇）[1]曹仪植.拟南芥[M].高等教育出版社,2004.[2