安丝菌素固体发酵及安丝菌素p-o制备

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1、研究生优秀毕业论文目录中文摘要．1Abstract．2前言日Ⅱ舌．．44安丝菌素研究现状4安丝菌素发酵影响因素8本课题研究目的及意义．．1l安丝菌素发酵及安丝菌素P．O制备131实验材料．．131．1菌株131．2培养基131．3主要试剂151．4主要仪器162实验方法．．182．1珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵孢子悬液制备182．2珍贵束丝放线菌ATCC31565液体发酵种子制备182．3安丝菌素TLC检测方法．．182．4安丝菌素HPLC检测方法182．5安丝菌素P．3标准曲线建立192．6珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵．192．6．

2、1珍贵束丝放线菌ATCC31565--ISP2培养基固体发酵．192．6．2珍贵束丝放线菌ATCC31565一发酵培养基固体发酵一2l2．7珍贵束丝放线菌ATCC31565液体发酵222．8安丝菌素分离纯化222．8．1珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵产物提取方法．．222．8．2珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵产物硅胶柱层析方法．．222．9安丝菌素水解反应(由合成室王玉成老师课题组完成)及P．0制备223实验结果与讨论一233．1ISP2培养基固体发酵安丝菌素233．2安丝菌素P一3标准曲线的建立．243．3珍贵束丝放线菌ATCC3156

3、5固体发酵培养条件优化273．3．1珍贵束丝放线菌ATCC31565固体种子培养基优化一27313．2珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵培养基优化．28万方数据3．3．3平皿装量优化．293．4安丝菌素分离纯化303．5安丝菌素水解反应及P-0制备3l3．6珍贵束丝放线菌ATCC31565其他探索工作．333．6．1ISP2+Val，ISP2+ScCl3培养基发酵产物提取分析343．6．2ISP2+异丁醇培养基发酵产物提取分析353．6．3液体发酵产物提取分析．373．7讨论与工作展望．．38全文总结39参考文献40文献综述：抗体药物偶联物研究进展42

4、英文缩略语53致谢．54硕士在读期间发表的学术论文55万方数据北京协和医学院硕士学位论文中文摘要安丝菌素固体发酵及安丝菌素P-0制备中文摘要安丝菌素(ansamitocin)属于苯安莎类抗生素，具有强烈的肿瘤细胞毒性，是开发抗体药物偶联物(ADCs)的重要原料。国内安丝菌素发酵水平不高、商业供应匮乏，为我国ADC药物研发带来一定难度。将安丝菌素发酵培养、分离提取及制备进行综合考虑，以提高安丝菌素产量、降低生产成本为目标的研究，具有应用前景。医药生物技术研究所作为我国微生物药物研发机构之一，也在进行ADCs类药物的开发，并且急需稳定的安丝菌素供应。在本研究中，

5、我们采用固体发酵珍贵束丝放线菌ATCC31565，建立了安丝菌素发酵，提取，分离纯化的实验室制备工艺流程。首先，我们建立了适合珍贵束丝放线菌ATCC31565稳定产生丰富孢子的种子培养基(葡萄糖：89／L，麦芽提取物：59／L，琼脂粉：159／L，酵母提取物：lg／L，NaCl：59／L)。通过摸索不同安丝菌素固体发酵培养基配方，获得了一种安丝菌素固体发酵培养基配方(葡萄糖：20g／L，玉米淀粉：30g／L，棉籽饼粉：30g／L，CaCl2：109／L，琼脂粉：209／L)，安丝菌素(纯度85％)产量稳定在约100mg／L，较ISP2培养基提高安丝菌素产量3

6、倍多。在此基础上，我们对珍贵束丝放线菌ATCC31565固体发酵培养物进行乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析，得到含安丝菌素P．2、P．3和P一4组分的混合物。参考相关文献报道，我们对安丝菌素发酵进行了一些验证和探索。例如，在培养基中添加异丁醇，提高了安丝菌素组分P．3的相对含量，但是安丝菌素总产量未见提高。在培养基中添加缬氨酸(Val)或者稀土元素钪(ScCl3)，未见安丝菌素发酵水平提高；同时，我们也进行了安丝菌素液体摇瓶发酵，效价与固体发酵相当，但液体发酵液粘稠度较高，给安丝菌素的分离提取带来了一定不便。最后，通过水解反应化脱去安丝菌素P．2，P．3，P4中的C

7、．3酰基侧链；采用制备型HPLC获得安丝菌素P．0纯品。安丝菌素P．0得率约82％(纯度大于99％)。提供安丝菌素样品1．59，用于医药生物技术研究所ADCs类药物的研发，解决了我所在ADCs类药物起始研发阶段对安丝菌素的迫切需求。关键词：安丝菌素；抗体药物偶联物(ADCs)；珍贵束丝放线菌；固体发酵万方数据北京协和医学院硕士学位论文AbstractSolid·statefermentationofansamitocinsandpreparationofansamitocinP·0AbstractAnsamitocinisabenzoquinoneansam

8、ycinantibioticwellknownfor