阿维菌素的发酵.doc

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1、阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵一、实验目的学习阿维菌素的发酵过程  二、实验原理阿维菌素的发酵共分三大工序:菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。 三、实验材料  1.菌株阿维菌素链霉菌斜面菌种。  2.培养基培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录Ⅲ。  3.仪器及药品接种环,培养皿,三角瓶,摇床,离心管,高效液相色谱柱,漩涡振荡器,微孔滤膜,淀粉酶,丙酮,乙酸乙酯,无菌水。 四、实验方法  1.实

2、验用菌种的制备  (1)单孢子悬液的制备向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水,用接种环刮取孢子,震荡打碎,过滤得到单孢子悬液。  (2)自然分离将得到的单孢子悬液稀释,分别涂布于含有分离培养基的平皿中,在28℃条件下培养7~9天。 2.发酵培养基和待检测发酵液样品的制备  (1)水解淀粉的制备称取玉米淀粉200g,先加入少量水混合均匀,加热使其糊化,降温至60℃,然后在糊化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶,恒温搅拌10min,最后加热至沸腾状态,保温5min,使残留的淀粉酶失活,降温待用。  (2)液体发酵铲取面积为0.5×0.5㎝2大小的斜面培养物,将其接种至种子瓶的培养

3、基中,28℃摇床培养22h后,按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中,28℃培养9天。(3)检测发酵液中阿维菌素样品的制备取5mL摇瓶发酵液于离心管中,3000r/m离心10min,弃去上清夜。在发酵液的沉淀物(菌丝体)中加入2mL丙酮,在漩涡式混合器上震荡1min,静置10min,如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯,震荡1min,静置10min,3000r/m离心10min,最后小心地吸取其中的上清夜作为样品,待检测。 3.阿维菌素含量的测定利用高效液相色谱法(HPLC)检测  (1)HPLC条件色谱柱:KromasilC185μm200×4.6mm流动相:CH2OH∶H2O

4、﹦88∶12(V/V)流速:1.0mL/min检测波长:244nm  (2)标准曲线的测定配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液(500~3000μg/mL),分别取各浓度标准溶液的过滤液5μL注入高效液相色谱仪中,测定其吸收峰值面积,然后对浓度(Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归,得到一元线性回归方程。 (3)效价的计算方法将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用0.45μm的微孔滤膜过滤,准确吸取滤液5μl注入HPLC中,记录色普图,将B1峰面积代入上述的回归方程中,计算得到发酵液中B1组分发酵单位(μg/mL)。  4.发酵液中菌体浓度的计算取体积为V1(mL)的发酵液,3000

5、r/m离心10min后,得到上清夜的体积计量为,V2(mL),那么发酵液的菌体浓度为:菌体浓度=[(V1-V2)/V1]×100%  五、实验报告绘制标准曲线,并记录实验结果。

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