sublytic c5b9诱导gmcs增殖和ecm分泌分子机制及其信号通路

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1、南京医科大学博士学位论文论文独创性声明本论文墅坠垃坐￡量坠：窆透昱g丛￡§擅殖狸星￡丛金塑金壬狃剑区基焦曼通整是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业：凫疰堂作者签名：主坚瘁日期：迎≥，61垒论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在

2、解密后遵守此规定。作者签名：蓬基瘟导师签名：南京医科大学博士学位论文中文摘要第一部分SublyticCSb一9诱导GMCs合成Tsp-1、TGF-I，l及其促细胞增殖和ECM分泌的作用目的：探讨亚溶解剂量的补体C5b．9复合物(sublyticC5b-9)刺激肾小球系膜细胞(Glomerularmesangialcells，GMCs)_E调血小板反应蛋白·1(Thrombospondin-1，Tsp一1)和转化生长N孑--beta1(Transforminggrowthfactor．pl，TGF—p1)的基因表达，促进GMCs增殖与细胞外基质(Extracellularm

3、atrix,ECM)分泌的作用。阐明Tsp—l与TGF—p1、GMCs增殖和ECM分泌之间的相关关系．方法：在确定sublyticC5b．9最佳浓度的基础上，将体外培养的GMCs作不同的分组处理．应用Real-timePCR和Westernblotting分别检测不同处理的GMCs，其Tsp-1、TGF—pI、细胞周期蛋(cyclinD2)和纤维连接蛋(Fibroneetin，FN)mRNA丰度扣蛋白表达水平，另用ELISA法测定GMCs培养上清中活化的TGF．13l的含量，并用3H．胸腺嘧啶核苷酸掺入量(3H．mymidineincorporation，3H-TdR)g

4、佥"查GMCs的增殖情况．此外，利用合成的TSp一1封闭肽段(GGWSHW，抑制TGF—pl的活化)，观察Tsp一1在dIsublyticC5b-9诱导TGF—pI的合成、GMCs增殖与ECM分泌中的作用。结果：培养的GMCs在sublytieC5b一9复合物(5％anti．ThylAb和4％正常血清)素4激后18h，其Tsp一1、TGF一9imRNA和蛋白表达水平明显上调，24h时cyclinDz、FNmRNA和蛋白的表达亦显著增加，同时GMCs呈现明显的增殖反应。,而GGWSHW(Tsp-1的封闭肽)能显著减少d口sublytieC5b一9诱导的TGF一131的合成，

5、并且FNmRNA和蛋白的表达水平也明显下调，但其对GMCs增殖影响并不显著．结论：SublyticC5b一9能够诱导GMCs合成Tsp-1、TGF．9l，促进GMCs增殖和ECM分泌，其EcM的分泌可能与Tsp一1、TGF—p1的合成有一定的2南京医科大学博士学位论文关系。【关键词】亚溶解剂量的补体C5b_9(sublyticC5b一9)；肾小球系膜细胞(GMCs)；血小板反应蛋白．1(Tsp一1)；转化生长因-P-betaI(TGF—p1)；GMCs增殖；细胞外基质(EcM)；细胞周期蛋白(cycIillD2)；纤维连接蛋白(F如南京医科大学博士学位论文第二部分沉默PD

6、．k／Akt基因对sublyticC5b．9tg进GMCs合成Tsp—I，TGF-pl及其细胞增殖和ECM分泌的影响目的：从基因水平上探讨沉默磷脂酰肌醇3．激酶(Pi3-k)／Akt基因对sublyticC5b．9诱导Tsp·I、TGF—pl的合成，促进GMCs增殖和ECM分泌的影响。方法：根据Pi3．1【／舭靶基因序列的不同区域设计出了8对小干涉RlqA(smallinterferenceRNA,siRNA)．体外将不同的Pi3-k／AM／／&夹状RNA(smallhairpinRNA，shRNA)转染A．GMCs后，筛选干扰效率最佳的Pi3一kshRNA(shPi3-

7、k)和AktshRNA(shAle)，将GMCs作相应的分组处理。I=XReal—timePC酗佥测各bgGMCs中Tsp-1、TGF．B1、cyclinD2和FINmRNA丰度，Westernblo牡iIlg检测磷酸化Akt(P。．Akt)，总Akt(T-Akt)，Tsp—l，cyclinD2和办潘白表达水平，另用ELISA法检测各组GMc谵养上清中TGF—Bl的含量。此外，用3H-TdR检查GMCs的增殖水平．结果：将8对shRNA质粒分别转染GMCs，发现，shPik3c3．2和shAktl-4能明显减低GMCs中P*-