rsv感染诱导的tlr4nfκb信号通路激活及pparγ激动剂的抑制作用

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1、温州医学院硕士学位论文RSV感染诱导白,OTLR41NF-KB信号通路激活及PPARY激动剂的抑制作用研究生：张同强导师：董琳主任医师陈小芳高级实验师李昌崇教授李孟荣教授(温州医学院附属育英儿童医院呼吸科浙江温州325027)中文摘要目的：1．通过观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺癌上皮细胞(A549细胞)12h、24h、48h后Toll样受体4(toll—likereceptor4，TLR4)／核因子一KB(Nuclearfactor-kappaB，NF—KB)信号通路中TLR4、NF—KB抑制蛋白(inhibitorofNF-K

2、B，IKBQ)、IKB激酶B(IKBkinaseB，IKKB)蛋白及mRNA的表达情况，探讨RSV感染对TLR4／NF—KB信号通路的激活作用。2．进一步观察不同剂量过氧化物酶体增殖物活化受体y(PPARY)激动剂15一脱氧前列腺素J：(15d—PGJ。)、罗格列酮、NF—KB抑制剂(PDTC)和PPARy抑制剂(GW9662)干预对RSV感染A549细胞上述蛋白及mRNA表达的影响，探讨PPARY激动剂对RSV感染时TLR4／NF—KB信号通路激活的抑制作用及其机制，并比较两种PPARY激动剂的抑制效果。3．为临床应用PPARY激动

3、剂治疗RSV感染提供实验依据，为RSV感染治疗药物的研发提供新的途径。方法：A549细胞传代培养后接种于六孔板，F12K培养液培养过夜，再随机分为6组；A组(15d—PGJ2+RSV组)，B组(罗格列酮+RSV组)、C组(DMSO+RSV组)、D组(PDTC+RSV组)、E组(GW9662+罗格列酮+RSV组)和F组(细胞对照组)。C组以含0．01％DMSO维持液预处理0．5h，再加维持液培养。A-E组以i00半数组织培养感染量(TCID50)RSV吸附2h后加维持液培养以制作RSV感染的细胞模型。造膜开始前A、B、D组分别给予15d

4、-PGJ：(10—20lamol／L)、罗格列酮(i0—30I-Imol／L)、PDTC(10umol／L)预处理0．5h；E组在罗格列酮预处理前先以同等剂量的GW9662预处理0．5h，余步骤同D组；F组未予处理在培养液中正常培养。各组分别在培养12h、24h、48h时收获细胞提取蛋白和RNA，应用Westernblot检测各组TLR4、IKKB及工KBQ蛋白表达情况；实时荧光定量PCR检测各组TLR4、IKKB及IKBQmRNA表达情况。温州医学院硕士学位论文结果：1．病毒滴度测定：RSV的TCID50通过Reed—Muench公

5、式计算为10‘4‘5／50u1。造模采用的病毒攻击量为100TCID50，即i012’5／50pl。2．RSV感染后TLR4、IKKB和IKBQ蛋白及mRNA表达的变化：与F组相比，C组在12h、24h、48hTLR4矛NIKK13蛋白及mRNA明显升高(均P<0．01)，IKBQ蛋白及mRNA表达量明显降低(22P<0．01)。TLR4和IKKB蛋白及mRNA表达量在感染后24h达高峰，IKBQ蛋白及mRNA表达量在24h最低，TLR4、IKKB、IKBQ蛋白和mRNA随时间的变化趋势基本一致。3．PPARy激动剂干预对TLR4蛋白

6、及mRNA表达的影响：A组和B组24hTLR4蛋白及mRNA表达量与C组相比呈剂量依赖性下降(均尺O．05)，其中20umol／L15d—PGJz和30umol／L罗格列酮干预后TLR4蛋白表达量最低，但仍高于细胞对照组(P；O．05)。20umol／L15d-PGJ。$n30umol／L罗格列酮在12h、24h、48hTLR4mRNA表达量与F组相比差异无统计学意义(乃0．05)。10l-tmol／L15d—PGJ：和同剂量的罗格列酮干预后24hTLR4蛋白及mRNA表达量的差异无统计学意义(D0．05)。20umol／L15d—P

7、GJ。干预后各时间点TLR4蛋白及mRNA表达量均明显低于同剂量罗格列酮干预后的表达量(均P(O．05)。D组与C、E组相比，TLR4蛋白及mRNA表达量在12h、24h、48h均明显下降(均P(O．05)，但仍高于F组(均P(O．05)。4．PPARy激动剂干预对IKKB蛋白及mRNA表达的影响：A组、B组24hIKK13蛋白及mRNA表达量与C组相比呈剂量依赖性降低(均P(0．05)；20“mol／L15d—PGJ：和30umol／L罗格列酮干预后24hIKKB蛋白及mRNA表达量最低，与细胞对照组相比差异无统计学意义(均P)O．

8、05)，而以上剂量PPARY激动剂干预后12h及48hIKKBmRNA表达量与F组相比无明显升高(均P>O．05)。20umol／L15d—PGJ2干预后12h、24h和48hIKKB蛋白及mRNA表达量均明显低于同剂量