脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制

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1、文献原文来源：PerezC,GerberS，BoilevinJ，etal.Structureandmechanismofanactivelipid-linkedoligosaccharideflippase[J].Nature,2015,524(7566):433-438.脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制镶嵌在膜屮的脂类具有较大的极性失部棊团，它们的翻转过程是缓慢的，并且极为不利的。因此，这一过程需耍翻转酶来催化，但其催化机制却是未知的。一个关于翻转反应的著名例子是可在蛋白质的N-连接糖基化作为供体的脂连接寡聚糖的转位。在空肠弯曲杆菌中，这一过程是由一种ABC转运体一一PglK

2、催化的。基于不同状态下的晶体结构，我们在此提出一个由PglK催化的脂连接寡聚糖的翻转机制。在体外，PglK能够运用内部和外部的构象，但是只有外部的构象j是催化翻转反应所需耍的。当脂连接寡聚糖链的焦磷酸-寡聚糖链头部基团进入了转位腔后，会与周边肽链上的正电荷发生和互作用；而脂质的多聚异戊二烯尾则结合并激活该转运体，但在翻转过程中，它仍位于脂双层中。我们所提出这种机制与适用于其他转运体的经典交替通路模型是有本质区别的。脂质从膜的一侧转至另一侧，被称为翻转，这不仅是维持膜的不对称性所必须的，而且也是许多生化过程的基础，比如说，信号传输、分泌和细胞内吞中的囊泡形成、膜蛋白活性的调节和蛋白

3、质天冬氨酰残基的糖基化。在动物中，脂质双分子层两侧的不对称性影响着许多活动，比如说凝血作用、巨噬细胞识别过程和细胞凋亡。在细菌屮，细胞璧成分的前体物质被耦联在脂质载体屮，随着脂质的翻转而运出细胞外，这对细胞壁的形成来说是极其重耍的。翻转反应是由主动的，或者说活跃的转运体蛋白所催化。这些蛋白包括通过消耗能量使得脂质在双分子层随机分布的爬行酶(scramblases)，由H+或Na+驱动的对向运输载体，和由ATP驱动的定向转运特定脂质的转运体。后者包括P4-ATPases和ABC转运体。尽管有了广泛的研宄，但关于由翻转酶催化的脂质快速翻转反应的过程和机制仍然知之甚少。直到现在，只有细

4、菌翻转酶的核心一一MsbA蛋白的晶体结构被报导公布出来，但是根据这点资料无法推断岀任何相关机制。除了缺乏结构方面的资料外，可用于天然底物翻转反应研究的可靠体外试验分析也太稀少。原核生物翻转酶的一种主要底物是Man5GlcNAc2-PP-dolichol,一种脂连接寡聚糖(LLO),它可以从内质网膜的胞质一侧转移至网腔一侧，然后寡聚糖链被转移到新合成肽链的天冬氨酸残基上，从而形成蛋白质的N-连接糖基化。在同源细菌的N-连接糖基化途径中，一种化学结构类似的LLO(GlcGalNAcsBac-PP-undecaprenyl)在人类致病菌空肠弯曲菌中出现了翻转。作为该过程的催化酶，Pgl

5、K是一种同二聚体的ABC转运体，并且在细菌蛋白质N-连接糖基化过程中是必不可少的。在寡聚糖链转移酶PglB作用下，己翻转的LLO的寡聚糖链部分被转移到受体蛋白质上；而十一异戊二烯焦磷酸盐部分然后在•I•一异戊二烯焦磷酸酶的催化下水解为单磷酸盐。为了探明由ATP驱动的LLO翻转反应的机制，我们研发出了体外分析方法，并测定出丫空肠弯曲菌的PglK在不同状态下的晶体结构。我们的研宂结构揭示了这样一种机制：只有PglK的外部构象与翻转反应有关，从而在允许寡聚糖链穿过转运蛋白的情况下，而附着在PglK表面的多聚异戊二烯尾仍然部分嵌在脂双层中。这一新提出的机制与用于解释目前研究的大多数转运蛋

6、白催化机制的交替通路模型迥然不同。体外实验中PglK催化LLO翻转和ATP水解的活性人们之前已经釆用放射性同位素标记的天然脂质来研究多聚异戊二烯连接的寡聚糖的翻转过程。然而我们发现PglK无论是在体外还是在体内，都可以催化寡聚糖链有所缩短的LLOs。于是，我们再重组PglK和一种糖链部分为三糖的LLOs(tLLO),得到了一种蛋白脂质体。这种蛋白脂质体(Fig.la)有一个还原末端和网个N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine，GalNAc)部分。此外，还使用了纯化的糖基转移酶PglH。这种酶在空肠弯曲菌中的N-连接糖基化过程有着重要作用，它可以使tLLO的非

7、还原端最多加上三个GalNAc残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转的tLLO进行放射性标记，以便可以准确测定由ATP驱动的、依赖于PglK的tLLO翻转反应的速率。我们通过使用足量的UDP-GalNAc,来确保每一个tLLO分子均被加上了三个GalNAc分子，以便能准确测定tLLO是否翻转到蛋白脂质体的内部(Fig.lb)。通过用纯化的寡聚糖链转移酶PglB把结果中得到的寡聚糖链转移到荧光标记的受体多肽上，然后再进行SBS-PAGE分析，从而证实了tLLO转变为六糖LLO