畜禽隐孢子虫某些生物学特性分析

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1、中文摘要本文对我国畜禽隐孢子虫流行病学进行了深入调查，并对鸭源和鸡源分离虫株进行了形态学测定、动物交叉感染试验、致病性、内生发育和虫体超微结构研究；收集国内牛源和禽源隐孢子虫7个分离株进行了PCR和巢式PCR检测，PCR--RFLP分型和基于核糖体小亚基(18SrDNA)基因和70kDa热休克蛋白(HSP70)基因的种系发育，以确定畜禽隐孢子虫寄生的优势种类和发育生物学特性，并借助基因诊断技术确定我国畜禽隐孢子虫的基因型，以阐明我国畜禽隐孢子虫流行病学机制．【I．作者应用饱和糖溶液漂浮法和齐尼二氏抗酸染色法(Zieal—NeelsenStainingmethod)对河南省

2、鸡、鸭、猪、奶牛及奶牛场职工的隐孢子虫感染率进行了调查，除鸡为阴性结果之外，23群鸭群体感染率69．57'／,(16／23)；8个猪场113头个体样品阳性率17．7jl(20／113)；7个奶牛场按10％的比例采集70个样品，样品阳性率为40'A(28／70)；在另一项试验中，采集郑州亚伟奶牛场184头个体样品，阳性率22．3％(41／184)，粪便中卵囊密度鸭和猪相对较低，奶牛粪便中卵囊密度相对较高．没有发现奶牛场职工隐孢子虫感染．2．作者对河南鸭源和北京鸡源隐孢予虫进行了动物交叉感染试验．借助微分干涉和电镜技术将河南鸭源隐孢子虫分离株和北京鸡源隐孢子虫分离株鉴定为贝氏

3、隐孢子虫(Cryptosporidiumbailvyi)．￡baileyi感染引起增重降低，法氏囊萎缩。cbaileyi主要引起鸡、丝毛乌骨鸡、樱桃谷品种肉鸭呼吸道和法氏囊炎症．首次应用扫描电镜系统观察￡baileyi寄生引起喉头、气管和法氏囊黏膜上皮腔面的病理形态学变化．结果表明鸡和丝毛乌骨鸡对贝氏隐孢子虫易感性比鸭高；丝毛鸟骨鸡为cbaileyi新宿主．3．扫描电镜和透射电镜观察结果表明cbaileyi内生发育各阶段虫体主要寄生于气管、喉头、泄殖腔和法氏囊的上皮细胞细胞膜内并在细胞质外．首次发现成熟裂殖体内裂殖子释放方式的多样性并观察到小配子从成熟配子体的释放方式；滋

4、养体内充满直径约0．6um的球形颗粒．I型裂殖体8个裂殖子呈逆时针旋涡状或呈桔瓣状排列．II型裂殖体内含4个裂殖子，两种类型裂殖体的裂殖子之间填充直径0．3pm球形颗粒残体并包围着一个大的球形残体：带虫空泡可分为有球形残体和无球形残体两类，在球形残体下部与宿主细胞质之间有一均匀竖向排列的纤维状结构，无残体带虫空泡底部有微孔状结构和分泌物残迹，根据观察结果推测带虫空泡基部的梳状结构不具营养器官的功能，营养通道应为带虫空泡的底部．虫体可以寄生于杯状细胞顶部．系统观察到子孢子或裂殖子在钻入宿主细胞过程中由前端尖锥形演变到球形，再逐渐过渡到后端呈球形，前端呈圆锥状．钻入之后发育成

5、球形的滋养体．4．本试验成功建立聚合酶链反应(PeR)检测技术和巢式聚合酶链反应(NestedPCR)检测技术，并结合DNA快速纯化技术，可以直接检测家畜粪便中隐孢子虫卵囊．两种PeR均为隐孢子虫属特异性，PCR的最低检测值为100个卵囊／m1．粪便中卵囊最低检测值为10‘个卵囊／ml，即105个卵囊／g粪便．巢式PCR最低检测值<2．86个卵囊／m1．粪便中卵囊最低检测值为<2个卵囊／ml，即20个卵囊／g粪便．巢式PCR扩增片段SspI酶切结果：安氏隐孢子虫(Cryptosporidiumandersoni)经过酶切后产生420bp和361bp两个片段，￡bailey

6、i产生545bp和231bp两个片段．从结果看本试验所检测的6个分离株可以明显区分为Candersoni和C抛ileyi两个种．5．首次将巢式PCR扩增片段序列用于隐孢子虫种系发育研究，DNAStar分析软件聚类分析所做进化树表明安徽奶牛分离株和北京奶牛分离株与小鼠隐孢子虫(C．muris)牛基因型，即现在的安氏隐孢子虫(￡andersonD最为接近，同源性达到99．9jl和100％，形成一个单系群；宁夏鸡源分离株、北京鸡源分离株和河南鸭源分离株在进化树上形成一个单系群和贝氏隐孢子虫鸡基因型同源性达到100’I．因此安徽奶牛分离株和北京奶牛分离株candersoni；宁夏

7、鸡源分离株、北京鸡源分离株和河南鸭源分离株为cbaileyi．牛源分离株和禽源分离株基于18SrRNA基因全序列和HSP70基因扩增片段序列，经DNAStar分析软件聚类分析并绘制基因进化树。在基于18SrRNA基因全序列绘制的进化树上牛源分离株和禽源分离株分布在不同的进化枝上，牛源分离株与小鼠隐孢子虫牛基因型，即安氏隐孢子虫candersoni形成一个单系群，二者同源性为99．9％；与小鼠隐孢子虫的另一个单系群，即小鼠隐孢子虫鼠基因型之间的同源性为97．7％，序列差异百分率为0．9％．北京鸡源、河南鸭源、宁夏鸡源3个分离株与