玉米纹枯病病原诱导启动子pgrmzm2g084947调控元件的鉴定与功能验证分析

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1、符号说明：煳燃JillY258考4。1。苔SAsalicylicacid水杨酸SARsystemicacq回redresistance系统获得抗性ROSReactiveoxygenspecies活性氧SDSsodiumdodecylsulfate十二烧基硫酸铀TALtranscriptionactivator-like转录激活因子类似物5-Bromo-4-ch1oro-3-indolyl-be钮-D-glucuro5-澳-4-氯-3-昭

2、睐葡萄糖昔X-Glucnidecyclohexylammonium

3、salthydrate酸目录中文摘要IAbstractIIl前言．11．1启动子概述11．1．1启动子的结构与功能11．1．1．1启动子中的保守元件21．1．2植物启动子的类型．．31．1．2．1组成型表达启动子31．1．2．2组织特异性启动子31．1．2．3诱导型表达启动子。．．41．1．2．3．1物理因素诱导的启动子．41．1．2．3．2化学因素诱导的启动子．61．1．2．3．3生物因素诱导的启动子．71．1．3启动子的研究方法。81．1．4启动子活性检测中使用的报告基因．．101．2玉米纹枯病概述1

4、O1．2．1病原菌111．2．2症状。111．2．3病原菌的侵染循环121．2．4玉米纹枯病的防治121．2．5玉米纹枯病菌抗性研究．121．2．6玉米纹枯病的致病机制．131．3研究的目的和意义152实验材料和方法152．1植物材料152．1．1菌株与载体152．1．2材料处理方法152．1．2．1玉米纹枯病菌的培养。152．1．2．2常用酶与生化试剂一152．1．2．3常用仪器162．1．2．4溶液及培养基的配制。162．2pGRMZM2G084947启动子表达载体构建162．2．1PCR引物设计。．

5、．162．2．2B73基因组DNA的提取172．2．3pGRMZM2G084947启动子片段的扩增172．2．4启动子片段的切胶回收和酶切。172．2．5空载体和目的片段的酶切产物纯化。172．2．6感受态细胞的制备182．2．7热激转化大肠杆菌DH50【．．182．2．8质粒DNA的提取．．182．2．9电转化农杆菌感受态细胞．182．3转基因阳性水稻的获得182．3．1农杆菌介导的遗传转化．192．3．2转基因水稻阳性检测．192．3．2．1水稻基因组DNA提取192．3．2．2PCR阳性检测192．

6、3．2．3GUS组织化学染色．192．3．3GUS定量分析192．3．4玉米纹枯病菌YWK．196接种水稻202．4pGRMZM2G084947启动子各截短载体的构建202．5农杆菌介导的烟草瞬时表达转化202．5．1玉米纹枯病菌YWK-196接种烟草202．5．2农杆菌介导的烟草瞬时表达转化一212．6GFP的定性及定量分析213结果与分析．．213．1pGRMZM2G084947启动子的结构分析2l3．2pGRMZM2G084947启动子表达载体的构建223．3转基因水稻阳性鉴定233．4pGRMZM

7、2G084947启动子的组织表达模式243．5pGRMZM2G084947启动子的病原诱导表达模式253．6构建不同截短启动子的重组载体并在本生烟上瞬时表达验证263．7确定pGRMZM2G084947启动子病原诱导的核心区域284讨论．3l5结论33参考文献34致谢．43附录I实验试剂44附录Ⅱ实验仪器45附录Ⅲ常用培养基配方46附录Ⅳ常用实验方法49附录V研究成果50山东农业大学硕士学位论文中文摘要玉米纹枯病(maizesheathblight)是全世界玉米产区广泛发生且危害严重的世界性病害之一。然而

8、目前对玉米纹枯病抗病的分子机制研究甚少，抗病路径不清晰，还未鉴定出主效的抗病基因且抗性种质资源比较缺乏。因此，积极探究玉米纹枯病抗病路径对病害防治至关重要。前人的研究表明对玉米抗病基因的克隆以及启动子的分离可以深入了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。本课题组通过转录组测序技术(RNA．seq)对玉米B73接种玉米纹枯病菌YWK．196和YWK．62，确定了300个差异表达基因。锹^亿^犯G嬲4舛7基因是筛选到的候选基因之一，其接种玉米纹枯病菌YWK．196后上调表达。分离克隆启动子并鉴定受病原

9、诱导的特异调控元件可以为抗病品种的培育和抗病基因功能的研究提供更精细的可能。本文利用PCR技术克隆该基因上游约2kb的启动子片段并构建表达载体，通过在水稻中花11中做遗传转化，发现该启动子能快速且强烈的响应玉米纹枯病菌YWK．196的诱导，且在幼叶和成株期茎等组织中的表达量较高。参考启动子预测软件PLACE对启动子的分析结果，利用烟草瞬时表达系统检测报告基因的表达，对启动子片段进行截短分析。首先确定了一1144bp至一1084