抗her-2单克隆抗体的应用分析及其工程抗体的研制

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1、中国科学技术人学博七论文摘要摘要：Her．2／neu原癌基因编码一个185kDa的受体酪氨酸激酶，在乳腺癌等很多肿瘤细胞的表面过表达。Her-2是一个重要的肿瘤标记物，它的过表达对肿瘤具有重要的预后和预测意义；它还是一个很好的肿瘤治疗靶分子；Her-2作为一个生长因子受体，在细胞的信号转导途径中起到了关键的调节作用。用本实验室通过表面表位包埋法制备的三株杂交瘤细胞制备腹水，纯化得到了抗Her一2／neu单克隆抗体A18、A21和A22。对抗体的稳定性和结合特异性进行了鉴定，结果表明它们能够非常特异地与H

2、er-2蛋白结合，抗体的效价高，稳定性好，在临床诊断肿瘤抗原Her．2中具有很大的应用价值。为Her一2免疫组化诊断试剂的研制和开发奠定了基础。对三株单抗的抑癌活性进行研究，结果表明，A18、A21和A22能够在体外抑制过表达Her-2细胞的生长，并能提高细胞对化疗药物的敏感性。因此可以作为Her．2特异性的拮抗剂，具有治疗过表达Her-2肿瘤的应用前景。利用A18和A21两株单克隆抗体，建立了夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测可溶性Her-2蛋白的方法，并对肿瘤病人血清中Her-2蛋白含量进行了检测。

3、结果表明这个方法具有很好的稳定性和实用性，特异性和灵敏度都较好。实验还验证了血清Her-2是一个很好的肿瘤标记物，并且与肿瘤的转移相关。成功制备了抗体胶联的亲和柱，并利用亲和层析的方法得到了纯化的Her．2细胞膜抗原，可作为血清检测方法中的标准抗原。构建了A18单链抗体和嵌合抗体，并在大肠杆菌中表达了有活性的A18单链抗体；利用谷胺酰胺合成酶系统(GS系统)，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO．K1细胞)中表达了有活性的A2l嵌合抗体，构建了稳定表达的细胞株；对A2l嵌合抗体进行纯化和性质鉴定，结果表明表达的抗

4、体能够特异性地识别Her一2抗原；在所筛选得到的两百多个表达A21嵌合抗体的CH0一Kl细胞株中筛到一株不依赖MSX生长并且表达量较高的细胞株，己进入滚瓶中培养，并有希望进一步扩大培养和进行抗体的纯化。用噬菌体展示技术对A18、A21JflIA22Z株单抗的表位进行分析，结合X,{PDB数掘库中Her-2晶体结构的分析，表明A21年I]A22单抗识别的抗原表位可能是一个11中国科学技术大学博士论文摘要完全相同的线性表位，该表位在Her-2抗原胞外区的IV区；A18可能识别一段空间表位，但是确切的表位尚未

5、确定。对A18抗体进行晶体生长的初步研究，表明A18抗体的长晶体的条件可能依赖二FLi2S04，C02+可能也有助于晶体的生成。最后，有关Her一2在细胞信号转导途径中的功能的初步研究结果表明，Her一2有可能定位于细胞核：Her-2的过表达影响了细胞中很多蛋白的磷酸化，但是具体的蛋白还没有确定。需要进一步深入和细致的研究。关键词：Her．2／neu(p185)；单克隆抗体；诊断；单链抗体；嵌合抗体；抗体表位；核定位；蛋白磷酸化111!里型堂垫查奎堂竖圭垒奎垒!壁!型Abstract：Theoncoge

6、neHer．2／neuencodesart185kDareceptortyrosinekinase，whichisoverexpressedonthesurfaceofmanycancercellsincludingbr6astcancercells．Itisaveryimportanttumormarker．Itsoverexpressionplaysanimportantroleintheprognosisandpredictionofcancers．Itisalsoagoodtargetforca

7、ncertherapy．Asanepidermalgrowthfactorreceptor,itactsasakeyregulatorinthesignalIransductionofthecells．Theascitisofthehybridomasthathavebeenestablishedby“surfaceepitopemasking”method，werepreparedandthreeanti—Her-2monoclonalantibodiesAI8，A2IandA22werepurifi

8、edandcharacterized．TheresultsshowedthatallofthemcanbindtoHer-2proteinspecificallyandalsohavehighstabilityandhightiter．TheythushavethepotentialsfordiagnosisofcancersoverexpressingHer一2Thestudyoftheanti。canceractivityoftheth