知母有效成分对脑缺血的保护作用及其机制分析

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1、中文摘要中文摘要随着人口老龄化的加剧，脑血管病，尤其是缺血性脑血管病越来越成为威胁人类健康的主要疾病之一，它不仅严重损害了患者的健康和生命质量，也给社会和家庭带来了沉重的负担。因此，明确脑缺血损伤的病理生理机制，研制和开发出新型、有效、副作用小的防治药物势在必行。脑缺血的病理生理机制复杂，研究认为其与缺血再灌注后能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、自由基大量产生、细胞内钙超载、血小板激活、炎症损伤等诸多因素相关。现今血小板活化、炎症免疫损伤、核转录因子的调控下细胞因子的释放以及粘附分子的表达等机制越来越受到研究者的重视。知母有效成分(化合

2、物9714)是军事医学科学院放射医学研究所提供的一种来源于中药知母的含有两个糖链的水溶性甾体皂苷化合物，结构类似糖皮质激素。本课题根据知母有效成分(化合物9714)的结构特征，并结合脑缺血的研究现况，从整体、细胞、分子等不同水平，体内外研究相结合，利用生化测定、免疫组织化学、酶联免疫、分子生物学、细胞培养等多种方法系统分析探讨了化合物9714防治脑缺血损伤的药理作用及可能机制，为研究开发抗脑缺血新药提供一定的理论和实验依据。研究共分为以下五个部分：1化合物9714对实验动物脑功能衰退的改善作用学习记忆能力下降是脑缺血致脑功能障碍中的一

3、种典型表现。本实验采用双侧颈总动脉结扎这一经典脑缺血模型，用Morris水迷宫测定各组动物空间学习记忆能力的差异，用HE染色及SABC免疫组织化学染色分析化合物9714对脑缺血模型大鼠病理形态学及神经生长因子、粘附分子表达的影响；同时鉴于胆碱系统的功能紊乱、胆碱受体密度降低与学习记忆、认知障碍、脑功能衰退之间的重要关系，同时鉴于胆碱系统的功能紊乱、胆碱受体密度降低与学习记忆、认知障碍、脑功能衰退之间的重要关系，实验中采用M受体阻断剂东莨菪碱ipo．5mg／kg致获得性记忆障碍小鼠模型，观察化合物9714对模型小鼠学习记忆能力的影响，及

4、对其海马中胆碱能受体的影响。结果表明，化合物971410mg／kg、20mg／kg、40mg／kg造模后连续给药40天，可以明显改善脑缺血大鼠的学习记忆障碍；改善神经细胞的变性坏死；增强脑皮质中脑源性神经生长因子(BDNF)的表达，降低细胞问粘附分子一l(ICAM-1)的表达；化合物971415m∥kg、30mg／kg、60mg／kg连续预防给药30天，能明显改善获得性记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力，并明显上调其海马中胆碱能M1受体，同时具有明显上调N受体亚型旺7(Ntx7)的作用趋势，与空白组相比有显著性差异，对N受体亚型毗无明显作

5、用。2化合物9714对局灶性脑缺血大鼠的保护作用常用的脑缺血模型包括全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型两大类。本实验采用FeCl3化学敷贴法致大脑中动脉血栓形成(MCAT)模型及栓线法致大脑中动脉(MCA)缺血知母有效成分对脑缺血的保护作用及其机制研究再灌注模型，观察化合物9714对脑缺血大鼠神经症状、脑梗塞范阅、脑水含量、脑血流量及多项生化指标的影响。结果显示，化合物971420m∥妇、40mg／醚明显缩小MCAT模型大鼠的脑梗塞范围，改善其神经症状，并显著降低患侧脑水含量，夏薯脑水肿；化合物971410mg／kg、20mg／kg、40

6、m∥kg能显著减低脑组织表面滴加FeCl3致血栓形成模型大鼠造模后50min时的脑血流量下降幅度，并延长脑血流量下降50％所需时间；化合物971420mg／kg、40mg／kg能明显降低栓线法致MCAO再灌模型大鼠脑组织中MPO活性、提高T-SOD活性、降低MDA含量，以及降低T-NOS、i-NOS活性、减少NO含量。3化合物9714对血栓形成、血小板聚集和血液流变学的影响血栓形成是引起缺血性脑血管病及血栓栓塞性疾病的重要病理过程之一，与血管壁损伤、血液成分异常及血流动力学改变密切相关。研究表明，脑缺血后血小板激活，血液流变学异常，血

7、栓易于形成。血小板活化是动脉血栓的起始因素，花生四烯酸代谢通路是其活化的重要途径之一。本实验采用动静脉旁路血栓形成模型，胶原、ADP诱导血小板聚集模型，以及皮下注射肾上腺素加冰水浸泡致急性血瘀模型，观察了化合物9714对动静脉旁路血栓、血小板聚集、血液流变学以及花生四烯酸代谢通路的影响。结果表明，化合物971410mg／kg、20mg／kg、40mg／kg能明显抑制动一静脉旁路血栓形成；明显抑制胶原、ADP诱导的大鼠血小板聚集；明显降低急性血瘀模型大鼠金血粘度及血浆粘度，提高其红细胞变形性，降低红细胞聚集性；以及能明显降低MCAO再灌

8、注模型大鼠血浆中TXB2／6．Keto．PGFl吐比值。同时体外实验中我们首次发现，化合物9714发挥血小板聚集作用的有效成分为其代谢产物(104，10一，10。mol／L)，而9714原药无此作用。这可能正是药效学实验