猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒混合感染的诊断与防制分析

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猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒2型和猪瘟病毒的混合感染的诊断与防制分析夏伟1、2李鹏1危艳武3张宇辉2罗玉均2冯春复21、黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆1633192、哈尔滨维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨1500013、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室哈尔滨150001摘要:2011年12月，南方某大型猪场爆发以母猪流产，死胎，弱仔，哺乳期仔猪发生体温升高，皮肤发绀，呼吸衰竭，顽固性腹泻；保育仔猪发烧，聚堆，皮肤红，昏睡，腹股沟淋巴结肿大为主要症状的疾病，死淘率高。剖杀3头发病哺乳仔猪，3头死亡保育猪取淋巴结、脾、肺脏病变组织用PCR，RT-PCR方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，圆环病毒2型，猪瘟野毒为阳性，结合本病的临床症状和病理剖检确诊为猪繁殖与呼吸综合征，圆环病毒2型，猪瘟的混合感染。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒；圆环病毒2型；猪瘟病毒；混合感染；诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内一种重要的猪传染病,1996年哈尔滨兽医研究所郭宝清首次证实我国有PRRS存在[1]，并从繁殖障碍猪群分离到PRRSV[2]。近几年对我国发病猪群的血清检测结果表明，该病现已存在于我国大部分地区[3]，并且呈暴发式流行，给养猪业造成了极大的经济损失。特别自2006年“猪高热病”流行后，据有关研究表明，猪繁殖与呼吸综合征变异毒株是由普通猪繁殖与呼吸综合征病毒的NSP2段基因发生了缺失变异而来，其临床症状主要是出现“三高一低”即高热（40℃以上）、高发病率、高死亡率、低治愈率；猪群出现皮肤发红，个别有神经症状，能导致母猪流产甚至死亡，给养猪业的发展带来重创。猪圆环病毒2型（PCV2)感染已经是威胁当前世界养猪业的一个重要疾病，1991年PMWS首次在加拿大被发现，目前已证实呈世界性流行。PCV2感染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重，给养猪业造成巨大的经济损失[4,5]。我国学者在我国许多地方都分离出了这种病毒,且和其他病毒混合感染的情况日益明显，PCV-2感染病例在临床上经常可见。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高致死性、烈性传染病。近几年随着我国规模化养猪业的发展,猪瘟的发生出现一些新特点,表现为发病年龄小、散发流行、混合感染以及非典型性或隐性等特点[6]，这又给本病的防治带来了很大的困难。生产实践中，PRRSV、PCV-2混合感染[7]，PRRSV、CSFV混合感染[8]，CSFV、PCV2混合感染[9]最为常见。本试验应用PCR，RT-CR方法结合临床症状和病理剖检对上海某猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），圆环病毒Ⅱ型（PCV2)，猪瘟病毒（CSFV）混合感染进行了确诊,从而为猪场防制本病，制定合理的免疫程序提供科学依据。1材料与方法1.1　病料来源　来自上海某猪场的6份发病猪和死亡猪的肺脏、脾脏、淋巴结等脏器，编号，3、4、5号为哺乳仔猪，6、7、8号为保育仔猪。冷冻运送，-20℃保存备用。1.2酶和其他试剂　PCR扩增试剂盒、饱和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、提取总RNA用TRIzol,BioFlux公司产品，Cycle-PureKit,OMEGA公司产品。DL2000Marker，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0购自大连宝生物有限责任公司；其他试剂均为分析纯试剂。1.3　引物设计及合成根据GenBank上发表的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oli-go6.0软件设计引物， 上游引物5′-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3′，下游引物：5′-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3′，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株）和非缺失株（经典PRRSV毒株）预期扩增产物长度分别约263bp和350bp。由宝生物工程(大连)有限公司合成。根据已发表的PCV-2核酸全序列合成了1对特异性的PCR引物。上游引物:5′-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3′:下游引物:5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′。扩增目的基因片段长为1057bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。参考GenBank中公布的猪瘟病毒（CSFV），石门（shimen）株基因组，设计合成了1对CSFV特异性的引物Csfv-F：5ˊ-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3ˊCsfv-R：5ˊ-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3ˊ由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4　病料处理及DNA的提取将组织样品称量、研磨，制成匀浆后反复冻融3次，取上清液按照常规方法提取样品总DNA参照文献[10]1.5　RNA的提取及cDNA合成参照文献[11]1.6　PRRSV—RT-PCR反应　按下列组成配制PCR反应体系25μL：RnaseFreeddH2O10.5μL，MgCL2(25mmol/L)5μL，dNTPMixture：2.5μL，10×OneStepRNAPCRbuffer2.5μL，引物(20pmol/μL)F29230.5μL、R32720.5μL，AMVReverseTranscriptaseXL0.5μL，AMV-OptimizedTaq0.5μL，RanseInhibitor0.5μL，模板2μL。反应条件为：50℃30min，94℃2min。94℃30s，58℃30s，72℃45s，共40个循环；72℃延长10min。1.7　PCV-2—PCR反应按下列组成配制PCR反应液：10×PCRBuffer1.5μL，ddH2O10.4μL，MgCL2(25mmol/L)1.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上下游引物(20μmol/L)各0.3μL，DNA模板0.5μL；共15μL。将上述反应液加入到PCR反应管中，轻轻混匀。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s、55℃30s、72℃45s，35个循环；72℃10min。1.8CSFV—RT-PCR反应按下列组成配制PCR反应液：10×PCRBuffer1.5μL，ddH2O10.4μL，MgCL2(25mmol/L)1.5μL，dNTPs(10mmol/L)0.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上下游引物(20μmol/L)各0.3μL，cDNA模板0.5μL；共15μL。将上述反应液加入到PCR反应管中，轻轻混匀。反应条件：94℃预变性12min；然后94℃45s、55℃45s、72℃1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。1.9PCR产物鉴定　用1%琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察结果，以PCR产物中出现以PCR产物中出现263bp，1057bp，602bp条带的样品为阳性。 2防制措施2.1　对发病较重的猪及时淘汰，病死猪深埋处理。流产母猪，同窝发病仔猪进行隔离饲养观察。圈舍及用具彻底消毒。2.2　对全群未发病猪用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头份）进行紧急免疫接种，剂量为2头份/头（配种至妊娠85天母猪不免）。2.3　猪瘟疫苗免疫7天后全群未发病猪实施哈兽研牌猪蓝耳病弱毒疫苗（CH-1R株）紧急免疫接种，保育猪2头份，育肥猪、后备猪3头份，种公、母猪3头份（妊娠80天后重胎母猪不免）。待疫情稳定后 ，种母猪配种后40天免疫蓝耳病灭活疫苗4毫升/次，间隔21天再肌注一次。种公猪一年2次，每次肌注4毫升。另外定期监测公猪精液蓝耳病野毒感染情况，野毒感染的公猪及早淘汰。2.4　用哈兽研牌猪瘟兔化弱毒疫苗（4000RID/头）对初生仔猪实施超前免疫，剂量为0.5头份/头，50日龄进行第二次免疫2头份。2.5　全群种公、母猪，商品猪接种哈兽研牌猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）2毫升，哺乳仔猪14日龄免疫2毫升，疫情稳定后14日龄免疫1毫升，35日龄1毫升。2.6　经实验室诊断后，对该场除采取常规隔离、消毒、抗继发感染，提高饲料营养等综合防制措施外，对未发病猪群进行猪瘟疫苗，蓝耳病弱毒疫苗及圆环病毒2型疫苗紧急免疫接种，使疫情很快得到缓解。3讨论与分析3.1　根据该场临床症状，病理剖检，PCR及RT-PCR技术最后确诊为PRRSV，PCV2，CSFV混合感染。调查其发病原因，我们发现本场2011年11月1日之前猪群生产一直稳定，但是猪场分别在2011年9月下旬，10月下旬从外场引进体重平均100斤左右的后备猪106头，未经隔离直接与本场后备猪混群饲养。外引后备猪最先发病，本场后备猪后发病从体重150斤以上的开始蔓延到初产母猪，而本次疫情初产母猪流产比例很高，可能是疫情发生的原因。3.2　本场过去几年后备猪配种前一直没有进行过蓝耳病疫苗的免疫，也没有采取其他预防措施，配过种的后备猪抗体是否转阳不清楚。是否获得坚实免疫保护不得而知。后备猪与外引猪，后备猪与经产母猪等不同猪群混群恰恰增加PRRSV交叉感染的机会。如果母猪接种疫苗前就存在PRRSV持续感染，病毒血症。再使用蓝耳弱毒疫苗采用“一刀切免疫”，就会增加母猪发病的风险，最近几年关于给妊娠后期母猪接种蓝耳病活疫苗导致猪群发病的病例屡见不鲜。所以笔者建议待猪群稳定后给种猪群接种蓝耳病灭活疫苗，更安全，3-4周龄健康仔猪接种蓝耳病活疫苗，可有效降低仔猪水平感染发病的风险。3.3检测6头仔猪中，3头哺乳仔猪日龄均在10日龄以内。检测出PRRSV可见母猪经过胎盘垂直感染的可能性最大。经胎盘垂直感染新生仔猪，导致新生仔猪肺脏，脾脏等器官受损严重[12]。所以要高度重视猪场种猪群选留和免疫。3.4临床上出现一定比例哺乳仔猪、保育仔猪肌肉震颤，并伴有一定比例死亡，活下来的猪到保育阶段仍有肌肉震颤现象，经过诊断为猪瘟野毒感染（2/6)，本场尽管免疫了猪瘟疫苗但出现免疫失败，笔者认为可能有两个原因：一是本场是蓝耳病，圆环病毒阳性场，PRRSV，PCV2持续感染，造成猪免疫抑制，影响疫苗效果。二是本场一直采用猪瘟普免的方式来免疫疫苗，一年3次免疫，如果不定期监测猪瘟抗体水平，依靠经验无法判断猪群的免疫水平。3.5从本场检测结果（3/6)，PCV2感染阳性率相当高，特别是保育仔猪阶段最严重，说明这个病毒在猪群中普遍存在和流行。带毒猪长期排毒，威胁其他猪的健康，单一感染猪缺乏典型的临床症状与病理变化，与PRRSV共同感染能引起仔猪断奶后多系统消耗性综合征，表现为淋巴组织肿大、出血，肉芽肿性炎症，坏死性肝炎，仔猪消瘦、生长缓慢等特征性病变；混合感染能加重PRRSV对仔猪引起的间质性肺炎的严重程度[13]，另外学者研究表明PCV-2的感染会对猪的免疫系统造成损害从而抑制猪瘟疫苗的免疫效果[14]。而应用PCV2疫苗是预防圆环病毒2型感染，降低免疫抑制的主要手段之一，哈尔滨兽医研究所刘长明[15]对我国部分猪场研究表明疫苗接种猪群与空白对照组对比，免疫母猪结果显示，出生时死胎率下降了2.3%，初生仔猪成活率提高了7.6%，断奶时成活率提高了7.5%，主动免疫仔猪，保育阶段猪发病率下降了15.1%，死淘率下降了3.6%。并且猪场药物保健费用明显下降，提高了饲料转化率。这与疫苗免疫后机体产生能中和野毒的高水平抗体有关。4综上所述： 诊断结果表明此次疫情确实由PRRSV感染所致，PCV2和CSFV感染加重了疫情,其主要原因是猪场从外地频繁引种有关,所以猪场引种过程要慎重。由于PRRSV抗原具有多样性,个体和群体可水平持续感染,使防治变得较为困难,世界各国都制定了一些防治措施,主要是防止病毒的侵入和扩散,如严禁从疫区引种、淘汰感染猪群、限制带毒猪的移动等方法。在当前,采用全进全出的饲养制度,改善饲料营养和猪舍环境,减少猪群应激,疫苗合理免疫是预防该病暴发的可行办法。从检测结果看猪场要预防疫情的再次暴发,猪场必须重视猪蓝耳病、猪瘟和猪圆环病的预防和监测[16]。参考文献[1]郭宝清，陈章水，刘文兴，等.应用间接免疫荧光法从国内生殖障碍综合征猪群中检出生殖与呼吸综合征病[J].中国兽医科技，1996,26（3）;3-5.[2]郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996.18（2）:1-4.[3]李华，杨汉春，张晓梅，等.猪血液和淋巴组织中淋巴细胞亚群表型分布[J].农业生物技术学报，2001，(1)：834-838.[4]ChaeC.Areviewofporcinecirovirus2-associatedsyndromesanddiseases[J].JVet,2005,169:326-336.[5]朗洪武，张广川，吴发权，等.断奶猪多系统衰竭综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技,2000,30(3):3-5.[6]姚文生，范学政，王琴，宁宜宝,等.我国猪瘟流行现状与防控措施建议[J].中国兽药杂志，2011，45(9):44～47，55.[7]李玉峰，王先炜，姜　平，等上海地区出现猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒混合感染[J].中国兽医学报，2003，23（5），442-444.[8]朱文豪，王治方，徐引弟，郭小参，张玉杨，等.猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟混合感染的RT-PCR诊断[J].中国畜牧兽医，2009,36（12）,153-154.[9]陈义祥,黄　夏,刘翠权,胡丽萍,陈芳芳,黄胜斌,何　丹,刘　棋，等.猪瘟病毒与猪圆环病毒2型混合感染的检测[J].动物医学进展,2005,26(9):90-92.[10]范培虎,危艳武,郭龙军,吴洪丽,黄立平,刘长明，等.2005年-2010年我国部分地区PRRSV流行毒株的遗传变异分析[J].动物医学进展,2011,32(3):1-7.[11]李　曦，符　芳，李　媛，王靖飞，崔尚金，童光志，等断乳仔猪多系统衰竭综合征的病原学调查[J].中国兽医杂志，2006,42（9）：21-22.[12]吴东来,郭宝清,李桂芝,蔡雪晖,王继科,褚桂芳,等猪生殖-呼吸道综合征病毒抗原在死胎及新生仔猪体内的分布[J],1999，21（2），128-129.[13]温永俊，吴国军，蔡雪辉’，刘永刚，王洪峰，姜成刚，尹训南，等，猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染对仔猪致病性的评估[J]，中国预防兽医学报，2007,29（5），336-340,393.[14]潘　艳，李　军，禤雄标，陈泽祥，胡　帅，杨　威，谢永平，许力干，谢宇舟，等猪瘟疫苗在猪圆环病毒2型阳性猪场的免疫效果观察[J].动物医学进展，2010,31(11):23-26.[15]刘长明，危艳武，陆月华，黄立平，吴洪丽，张朝霞，温士刚，姜凤娟,等，猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）的研制与应用[J],畜牧兽医科技信息，2010,9,29-30.[16]王　波，张　鹏，杨增岐，张淑霞，党如意，等陕西省PRRSV与CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测[J].西北农业学报，2009，18(5):27-30.作者简介：夏伟（1977 ～），男，黑龙江哈尔滨人，硕士，主要从事规模猪场猪传染病诊断，防制与新技术推广工作。联系方式：手机：18845103383，E-MaiL:xiawei98340032@sohu.com.工作单位：哈尔滨维科生物技术开发公司地址：哈尔滨市香坊区哈平路678号邮编：150001