猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒混合感染的诊断与防制分析

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1、猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒2型和猪瘟病毒的混合感染的诊断与防制分析夏伟1、2李鹏1危艳武3张宇辉2罗玉均2冯春复21、黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆1633192、哈尔滨维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨1500013、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室哈尔滨150001摘要:2011年12月，南方某大型猪场爆发以母猪流产，死胎，弱仔，哺乳期仔猪发生体温升高，皮肤发绀，呼吸衰竭，顽固性腹泻；保育仔猪发烧，聚堆，皮肤红，昏睡，腹股沟淋巴结肿大为主要症状的疾病，死淘率高。剖杀3头发病哺乳仔猪，3头死亡保育猪取淋巴结、脾、肺脏病变组织用PC

2、R，RT-PCR方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，圆环病毒2型，猪瘟野毒为阳性，结合本病的临床症状和病理剖检确诊为猪繁殖与呼吸综合征，圆环病毒2型，猪瘟的混合感染。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒；圆环病毒2型；猪瘟病毒；混合感染；诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界范围内一种重要的猪传染病,1996年哈尔滨兽医研究所郭宝清首次证实我国有PRRS存在[1]，并从繁殖障碍猪群分离到PRRSV[2]。近几年对我国发病猪群的血清检测结果表明，该病现已存在于我国大部分地区[3]，并且呈暴发式流行，给养猪业造成了极大的经济损失。特别自2006年“猪

3、高热病”流行后，据有关研究表明，猪繁殖与呼吸综合征变异毒株是由普通猪繁殖与呼吸综合征病毒的NSP2段基因发生了缺失变异而来，其临床症状主要是出现“三高一低”即高热（40℃以上）、高发病率、高死亡率、低治愈率；猪群出现皮肤发红，个别有神经症状，能导致母猪流产甚至死亡，给养猪业的发展带来重创。猪圆环病毒2型（PCV2)感染已经是威胁当前世界养猪业的一个重要疾病，1991年PMWS首次在加拿大被发现，目前已证实呈世界性流行。PCV2感染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重，给养猪业造成巨大的经济损失[4,5]。我国学者在我国许多地方都分离出了这

4、种病毒,且和其他病毒混合感染的情况日益明显，PCV-2感染病例在临床上经常可见。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高致死性、烈性传染病。近几年随着我国规模化养猪业的发展,猪瘟的发生出现一些新特点,表现为发病年龄小、散发流行、混合感染以及非典型性或隐性等特点[6]，这又给本病的防治带来了很大的困难。生产实践中，PRRSV、PCV-2混合感染[7]，PRRSV、CSFV混合感染[8]，CSFV、PCV2混合感染[9]最为常见。本试验应用PCR，RT-CR方法结合临床症状和病理剖检对上海某猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），圆环

5、病毒Ⅱ型（PCV2)，猪瘟病毒（CSFV）混合感染进行了确诊,从而为猪场防制本病，制定合理的免疫程序提供科学依据。1材料与方法1.1　病料来源　来自上海某猪场的6份发病猪和死亡猪的肺脏、脾脏、淋巴结等脏器，编号，3、4、5号为哺乳仔猪，6、7、8号为保育仔猪。冷冻运送，-20℃保存备用。1.2酶和其他试剂　PCR扩增试剂盒、饱和酚、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC、提取总RNA用TRIzol,BioFlux公司产品，Cycle-PureKit,OMEGA公司产品。DL2000Marker，TaKaRaRNAPCRKit(AMV)

6、Ver.3.0购自大连宝生物有限责任公司；其他试剂均为分析纯试剂。1.3　引物设计及合成根据GenBank上发表的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oli-go6.0软件设计引物，上游引物5′-AGAACTGTGACAACAACGCTG-3′，下游引物：5′-GAGTCGATGATGGCTTGAGCT-3′，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株）和非缺失株（经典PRRSV毒株）预期扩增产物长度分别约263bp和350bp。由宝生物工程(大连)有限公司合成。根据已发表的PCV-2核酸全序列合成了1对特异性的PCR引物。上

7、游引物:5′-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3′:下游引物:5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′。扩增目的基因片段长为1057bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。参考GenBank中公布的猪瘟病毒（CSFV），石门（shimen）株基因组，设计合成了1对CSFV特异性的引物Csfv-F：5ˊ-AAGTAACAGAGACATGAATGG-3ˊCsfv-R：5ˊ-CCAAAAGGATAGGTAGGGT-3ˊ由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4　病料处理及DNA的提取将组织样品称量、研磨，

8、制成匀浆后反复冻融3次，取上清液按照常规方法提取样品总DNA参照文献[10]1.5　RNA的提取及cDNA合成参照文献[11]1.6　PRRSV—RT-PCR反应