木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

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1、木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的(1)它是利用未成熟的番木瓜(Caricapapaya)果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。(2)通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。二、原理木瓜蛋白酶(Papain)是一1种疏基蛋白酶，它分解比膜脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23000左右。在25°C，pH6.2时，1分钟生成liimol酪氨酸的酶景为1单位。木瓜蛋白酶是单条肽链，存211氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1个巯基，对酶活力是必需的，

2、激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和EDTA；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处存吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三、实验材料番木瓜汁；PEG（聚乙二醇，分子量为6000）;（NH1）2S04；三氯乙酸（TCA）；酪氨酸；考马斯亮蓝UI(仪器设备1）离心机4000-1000rpm2）752紫外分光光度计3）水浴箱4）冰箱5）榨汁机

3、玻璃器皿（以组为单位）（冷冻式或非冷冻式）试管（6），100mL烧杯（2），吸管（试剂瓶（1000mL、500mL、250mL等）5mL（l）、lmL（2）、0.5mL（1），漏斗（1）、玻棒（1），，移液管或移液器3）,滤纸（3-6:六、实验试剂配制及实验步骤试管编号012345标准酪氨酸溶液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）21.81.61.41.21紫外吸光度A275nm00.0660.1750.3000.4300.550氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A275nm,做标准曲线，曲线如下：酪氨酸曲线)粗酶

4、活测定1试剂(1)3mg/ml木瓜蛋白酶液(用0.lmol/L的磷酸缓冲液，pH7.2配制)(2)0.lmol/L的磷酸缓冲液，pH7.2(3)用0.lmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)配制含80腳ol/L半胱氨酸(4)1%酪蛋白溶液：用0.lmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)配制(5)15%三氯乙酸(TCA)溶液2方法量取酶液0.2mL，加入激活剂0.25mL于带塞试管中，在37°C水浴中保温8min,吸取预热371酪蛋白液（质量分数为1%）1mL加入此管，在37°C水浴中反应10min,加入三氯乙酸（TCA）2mL摇匀，静置5min;另取样液（己激

5、活）0.3mL置另一带塞试管中，加入TCA2mL,37°C保温10min后，加入预热至37°C的酪蛋白液1mL，静置5min,测2个管的A275nm值，同时做2个平行试验管号0（对照）1（样品）2（样品）酶液（ml）0.20.20.2激活剂（ml）1.81.81.837度预热10分钟1%酪蛋白（ml）01.01.037度水浴10分钟TCA(ml)2.02.02.01%酪蛋白（ml）1.000摇匀，静置5分钟过滤0D275nm0.0000.1030.108（三）纯化同定体系总质量为20.5g，在PEG（分子量6000）质量分数为22.0%,（NH4）2S

6、04质量分数为14.6%，pH值为5.0，粗酶添加景为7.5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力体积ml紫外吸光度A275nm上相90.32下相170.02）计算与结果9/17=0.529粗酶活=(0.103-0.0139)/10.496/181.2*100000/0.03=156.16上相酶活=(0.32-0.0139)/10.496/181.2*100000/0.02=804.7下相酶活=(0.02-0.0139)/10.496/181.2*100000/0.012=26.7酶分配系数

7、=上相酶活/下相酶活=804.7/26.7=30.14