个新的膜联蛋白亚家族—anxb1的鉴定及其抗凝血功能的研究

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1、中文摘要～摘要＼＼／cCl』是刊、树汉教授利用免疫筛选的方法，从猪囊尾蚴(c"，icez““Lfe／lulosae)eDNA文库中分离到的一个抗原基因。大量的研究证明，cCl不仅是一个重要的保护性抗原，而且可能参与了囊尾蚴细胞丝裂原信号传导途径，对于细胞的生长、分化具有重要的生理意叉。为进一步探讨cCl的生理功能，首先利用生物信息学(bioinformatics)软件对c口进行了序列分析，二、三级结构预测和基本理化特性预测。通过核酸水平和氨基酸水平的相似性搜索，发现cC]同膜联蛋白家族(annexinfamily)成员的序列相似性达到了40～60％。一般认

2、为，当两个基因的序列相似性大于30％，那么这两个基因就可能是同源基因。因此，cCl可能同Annexin基因同源；进一步利用多个蛋白质结构域数据库进行分析，发现cf，氨基酸序列中具有四个典型的Annexin重复区域。每个重复区域由70—100个氨基酸残基组成，包含一个“M-K／R—G-X—G-T-(38residues)-D／E”的基序；对cCl的二级结构进行预测，发现该蛋白以旺一螺旋为主，占氨基酸总数的57．8％。基本没有B一折叠出现；利用同源建模(hom0109ymodeIing)预测cCl的三级结构，发现cCl同AnnexinA5具有相似的拓扑结构。这

3、些预测和分析均表明，cO／具有Annexin蛋白典型的结构特征，因此很可能是Annexin家族的一个新成员。Annexin家族是在真核生物中广泛存在、具有重要生理功能的一类钙结合蛋白。因其在ca2+存在的，t-})mT能够和酸性磷脂结合，所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白(calcium-dependentphosphoiiPidbindingproteins)。将c口编码序列克隆到原核表达载体pGEX-5T中．转化大肠杆菌k802，在IPTG诱导下表达，得到GST融合蛋白。利用磷脂共沉淀法证明该融合蛋白在2mMCa“浓度时，能够和含磷脂酰丝氨酸的脂质体结合，

4、而且这种结合是可逆性的，加入钙离子螯合剂EGTA后能够和膜分离。以上结果说明，cCl具有Annexin基因的典型结构特征，同时也具有Annexin蛋白所共有的生物学活性，因此属于Annexin家族。同时，由于cCl同现有Annexin基因C端保守区域的同源性均低于60％，N博士掌位论文中文摘要端同源性低于2O％，因此cCl不属于任何一个已知的Annexin亚家族，而是一个新的Annexin亚家族成员。根据新的Annexin命名规则，cCl应该属于B类Anllexin基因，所以命名为AnnexinB1，简写为AnxBl。AnxBl是扃形动物(P1atyhel

5、minth)中首次被鉴定的一个Annexin成员，研究它的生理功能，不仅可以了解AnxBl对于猪囊尾蚴的寄生、移行、生长、发育等生命活动中的重要意义，为治疗和预防该类疾病提供新的药物靶点，而且可以将猪囊尾蚴作为一种结构简单的模式生物，研究Annexin在高等真核生物中的生理功能以及分子进化。所以接下来我们对AaxBl的生理功能作了初步的探讨。利用RT—PCR技术研究AnllexinB1在乃eniasolium不同发育阶段的表达，发现，InxBl是囊尾蚴阶段特异性表达的基因，可能与囊尾蚴的生长、发育和变态有关：研究中还发现，重组蛋白GST-AnxBl能够显著

6、延长部分激活的凝血活酶时间(KPTT)，因而具有很强的抗凝血活性，该凝血活性可能与AnxBl结构中四个ca”依赖性磷脂结合位点和两个“K-G—D”序列有关：在血液凝固过程中需要血小板的激活，以形成一个以磷脂酰丝氨酸(Ps)为主的磷脂膜催化表面，使凝血因子x、凝血酶原等凝血因子活化。由于膜联蛋白具有较强的钙依赖性磷脂结合活性，因而能够竞争『生抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合，从而抑制了凝血因子x等的活化，起到抗凝血的作用。anxBl的抗凝血机理至少说明两点：一是AnnexinB1本身不具酶活性，所以不会引起血液中凝血因子的减少，因而可能不会产生由于凝血因子的

7、减少而引起的出血等不良反应。二是该Anxgl的结合位点是活化血小板的膜磷脂，因而可能对以活化血小板为主要成分的主动脉血栓具有高亲和力，所以可用于血栓的导向显像，和以此为载体发展血栓靶向性的溶栓药物。但问题在于：如果把AnxBl作为抗凝血药物来用，需要考虑AnxBl是寄生虫来源的蛋白，具有一定的免疫原性：如果把AnxBl作为一种血栓靶向的载体来用，需要考虑AnxBl的分子量较大，为38kDa。因此需要进行基因的结构改造。根据anxBl具有四个同源结构域的特点，首先模拟构建了一系列突变体群，然后利用同源建模的方法对中文摘要各突变体进行结构预测，发现各突变体仍然

8、较好保持了钙结合的活性中心。通过能量和结构的优化，选择四个结构最为