rnai抑制nfκbp65基因的表达及对小鼠lewis肺癌细胞生物活性的影响

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1、广东医学院硕士学位论文RNAi抑制NF-ΚB/p65基因的表达及对小鼠Lewis肺癌细胞生物活性的影响姓名：刘明申请学位级别：硕士专业：@指导教师：梁统；周克元200905l矾触抑制NF．KB／p65基因的表达及对小鼠Lewis肺癌细胞生物活性的影响中文摘要【目的】NF-KB／p65是一类重要的细胞核转录因子，它能调控许多下游基因的表达，涉及到细胞的黏附、浸润、转移等方面。多项研究表明，NF．1(B／p65及其家族成员在许多人类肿瘤中都显示高表达。本研究拟利用IⅢA干扰技术，以》汴一诏／p65的mRNA为靶点，设计、构建NF-心／p65sbRNA的真核表达载体。特异沉默Ⅻ7-心／p65的基

2、因表达，探讨沉默NF-心／p65基因对小鼠Lewis肺癌细胞增殖、凋亡的影响及对细胞因子调控的作用。【方法】，在Gehb锄k查找NF．KB／p65cDNA序列(M61909)，利用Ambion公司提供的设计软件，按照RNAi的设计原则，筛选出3个NF．1cB／p65的干扰．靶点，同时设计一个阴性对照，并设计出相应的shRNA模板，通过T4连接酶，将互补配对的shRNA模板分别插入到pG∞髓il．1质粒中，构建四种重组质粒。用脂质体法将重组质粒分别转染入小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)中。RT．PCR检测各转染组mRNA的表达量的变化，West锄b10t检测各转染组NF．1cB／p65蛋白表

3、达量的变化，筛选出沉默效果最好的表达质粒。将筛选出的沉默效果最好的质粒转染LLc细胞，以空质粒组和空白对照组作为对照组，MTT法检测细胞增殖抑制情况，Hoechst染色检测细胞凋亡形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA法检测细胞培养上清液COX．2和TNF．0【的含量。【结果】测序结果显示，NF．1cB／p65sllIⅢA模板成功插入到pG∞懿il．1表达质粒中，成功构建sIlIⅢA表达质粒。与空白对照、空质粒对照及s僦le对照相比，干扰组smⅢA有效的降解NF一心／p65lll】RNA，尤其转染pG％esil-1-p65一s11IⅢA-2质粒组干扰效果更为有效。转染pGcIles

4、il．1．p65．sIlI矾A．2质粒组由于内源性NF．1cB／p65IIlIⅢA减少，NF．KB／1)65蛋白也相应的减少。MTT结果显示，在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低，细胞增殖速度减慢，生长受到抑制，转染后72h抑制率最高，干扰组与空质粒组、空白对照组相比，对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(氏O．01)。转染72h后，空质粒组的细胞细胞核呈弥散均匀荧光，且强度较弱，转染了干扰质粒的细胞可见典型的细胞凋亡形态，细胞核中可见致密的强荧光，荧光增强，胞核缩小碎裂，呈大小不等的不规则块状细胞碎片。转染sh眦leVector1．O．CMV．P65．ShRNA．2干扰质粒72h后，L

5、LC细胞出现明显的凋亡，细胞凋亡率为：10．6％。转染干扰质粒组较转染空质粒组、空白对照组TNF吨、COX．2水平均明显降低，差异有统计学意义(p

6、geneande仃ectofbioac廿vityonmouseLewisLungCeUsbyI瞒灿Abstract【objec饥e】NF．心／p65is觚iIllportant衄clcar们Ils耐ptionf．actor．TlleactiVationofNF．1cB／p65caIlregulatemeexpressionofmanygeIles．NF·心／p65playSa嘶ticalroleinc觚cerdeVelopment锄dpr0伊eSsionaIldc锄resistapoptosis-basest11】【Ilor羽】rveill雒cemechaIlism．hlⅡlissJtud

7、y，廿leeXpr销sionVeCtorsofNF一1①／p65sllI斟Awillbed鹊i印ed锄dcons咖cted．’111eiIlflu∞ceofcellprolifa眦io玛印optosisand畦圮哪l撕0nofcytokineonLewisl吼gc锄Cerwillbes硼iedbysileIlcingNF·’m枷5gene．【Methods】nreet鹕etsequ胁c伪ofNF·心／p65andas伽m