crrflp和mlpa基因诊断脊肌萎缩症的研究

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1、天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的脊肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)是一种以脊髓前角退行性变为特征的常染色体隐性遗传病，表现为下运动元性、进行性、对称性肌无力和萎缩，近端重于远端，下肢重于上肢。人群中发病率约为1／10000，突变基因携带频率为1／50．1／35¨21o居致死性常染色体隐性遗传病第二位，仅次于囊性纤维变。目前尚没有有效的治疗方法[3]，因此先证者的基因检查和群体中携带者的筛查工作对于遗传咨询、指导生育具有重要的作用。该病的致病基因为运动神经元存活基因SMN(survivalrnortorneurongene，SMN)，位于5q11．

2、2～13．3。SMN基因有2个拷贝，即SMNl和SMN2。SMNl和SMN2高度同源，二者仅有5个碱基的差别H1。一般认为SMNl为该病的主要致病基因，SMN2属调节基因，与疾病的严重性呈反比。研究认为，约95％的SMA患者存在SMNl第7和或第8外显子的纯合缺失和SMNl转变为SMN2，而约5％的患者是由基因突变引起的。因此，检测SMNl基因第7、8外显子缺失成为诊断该病的主攻方向。本研究分别采用以往应用最广泛的检测SMNl基因的聚合酶链式限制性片段长度多态性分析(PCR．RFLP)方法和最新的多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术对30例临床疑似SMA患儿及其父母进行基因诊断

3、，并对两种方法进行比较，分析两种方法对各类SMN基因缺失先证者诊断的一致性，评估MLPA方法对携带者检出的准确度。方法本研究采用盐析方法提取所有受试者外周血DNA，DNA的纯度和浓度均经核酸定量仪(NADODROP2000)测定。常规PCR．RFLP方法扩增SMN7、8外显子，用DralI和DdelI酶切PCR产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR及酶切产物，凝胶成像系统记录结果。同时利用MLPA试剂盒P021方法进行验证比较，计算黝研拷贝数，并对病人组、携带者组与正常对照组SMN2拷贝数进行比较，采用SPSS16统计分析。结果天津医科大学硕士学位论文根据实验结果共确诊24例为SMA

4、病人，即22例岛舢第7+8号外显子纯合缺失患儿和2例Ex7纯合缺失，两种方法结果一致。回顾分析临床表现，发病年龄，疾病进展等临床资料，确定I型9例，II型9例，Ⅲ型6例。其余6例PCR．RFLP方法未见异常家系中经MLPA方法分析发现1例患儿和2例母亲为SMNl外显子7、8杂合缺失携带者；MLPA方法还在SMA家系中发现3例“2+0”型携带者。MLPA方法共分析检出52例携带者和18例正常者。结果发现SMN2拷贝数在SMA患者中以4、5为主、携带者以2、3为主、正常人以1、2多见，其各拷贝数的频率分布在病人组与携带者组(x2=30．694)、病人组与正常人组(x2=21．997)

5、中p<0．001，而在携带者与正常人组(x2=3．5)p>0．05。结论与PCR．RFLP相比，MLPA更加简单、准确、高效，仅需要少量的DNA模板就能快速准确的定量SkgVl、僦还有助于区分表型和筛查携带者，是一种高效的遗传病基因诊断方法，能为遗传咨询提供可靠的信息，相信以后会在临床广泛应用。关键词：脊肌萎缩症MLPAPCR．RFLPSMN基N基因诊断天津医科大学硕士学位论文AbstractobjectiveSpinalmuscularatophy(SMA)isacommonautosomalrecessiveneuromusculardisordercausedbydegen

6、erationofneuronsintheanteriorhornofthespinalcord．Thedegenerationprocessleadstoprogressive，symmetricmuscleweaknessandmuscleatrophy．Anditismoreseriousproximalthandistal．Thefrequencyofthediseaseiscalculatedtobeapproximately1：10000withacarrierfrequencyof1／50—1／34．SMArepresentsthesecondmostfrequen

7、tautosomal．recessivediscorderaftercysticfiborosis．Currentlythereisnotreatmentforthedisease．So，theprobandsgroupofgenetictestsandthecarriersscreeningforgeneticcounselling，guidanceofgrowthhaveimportantrolesTheprimarySMAdisease-determationgeneist