人为操作因素对酶联免疫吸附法检测乙肝病毒血清标志物影响的探讨

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1、人为操作因素对酶联免疫吸附法检测乙肝病毒血清标志物影响的探讨摘要：目的ELISA技术在临床实验室的应用日渐广泛，成为快速诊断和确诊临床疾病的一项免疫诊断技术。但是，到目前为止国家相关部门尚未出台相应的实验条件要求、人员培训以及标准的操作流程，同时该技术实验操作和结果判断等环节较多，对临床结果影响较大，鉴于此，我们就目前临床实验中需要关注的地方进行阐述，以便更好地改进规范性实验技术步骤，有效减少临床检验的误诊。方法用试剂盒中抗-HBc，抗-HBe阴性对照标本按照操作说明书加样后，分别于0，5，10，15，20，30min后加入酶标记物。结果不同加酶时间可出现程度不同的假阳性，间隔时间越

2、长，标本的假阳性越多。结论不同加酶时间可出现程度不等的抗-HBc,抗-HBe抗体假阳性。为避免这种假阳性结果导致的差错，建议严格按照试剂盒说明书进行操作。关键词：假阳性；抗-HBc，抗-HBe;酶联免疫吸附试验乙型肝炎病毒(HBV)血清标志物的5项指标检测方法较多，但是目前临床应用最多的还是酶联免疫吸附试验(ELISA),其中抗-HBc，抗-HBe采用竞争抑制法。1资料与方法1.1试剂与材料1.1.1质控品购于贵州省临检中心质控品：20130111W,20130108W。1.1.2试剂均由珠海丽珠试剂股份有限公司提供。L1.3仪器北京天石SM-3酶标仪；北京天石ZMX988B洗板机；

3、上海医疗器械七厂HH.W21.Cu600型水浴箱。1.1.4样本血液样本来自本单位住院、门诊患者，真空抽血5ml，分离血清待检，共235份；用试剂盒中抗-HBc，抗-HBe阴性对照标本。1.2操作方法1.2.1.1将235份血清用生理盐水按1:30稀释，加入标本后立即加入酶结合物（使标本于酶结合物同步加入），37°C水浴30min,洗板，加入显色剂，加入终止液，酶标仪比色，213份为阴性（标本A450nm>2.0为162份，标本A450nm>临界值至2.0为51份）。1.2.1.2将213份阴性血清用生理盐水按1:30稀释，另准备试剂盒中抗-HBc，抗-HBe阴性、阳性对照标本，平行

4、做60孔，10孔一组分为A、B、C、D、E、F组，A组加入抗-HBe,抗-HBe阴性对照及标本后立即（0分钟）加入酶结合物，以此类推于5（B组），10（C组），15（D组）20（E组），30（F组）分钟加入酶结合物完成其他标本、阳性、阴性对照、及质控品，其他操作按标准操作说明书进行，分别获得各自情况下的比色结果。临介值（C.0）=阴性对照平均A值XO.5o1.3统计学方法采用F检验，样品率采用x2检验，统计采用Excel软件。2结果2.1抗-HBc，抗-HBe抗体检测间隔加酶结合物时间对结果的影响见表1、表2。从表1可见，加入标本后5min，再加入酶结合物，即有24份A450nm值〉

5、临界值0.1〜0.35的标本出现假阳性，表现为测定标本A450nm值明显下降至临界值0.1〜0.35的标本出现假阳性，表现为测定标本A450nm值明显下降至〈临界值0.7以内。随着加样后室温放置时间的延长，假阳性明显增多。放置时间彡20min时，假阳性显著增加，约达到放置时间5min组的5倍，加样后室温放置30min,本试验组的213份阴性标本仅剩110份仍为阴性结果。3讨论乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因组长约3.2kb,为部分双链环状DNA。乙型肝炎是危害严重的病毒性传染病，广泛流行于全世界，迄今为止，尚未发现无HBsAg阳性携带

6、者地区。我国的乙肝病毒感染率约60%〜70%;乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此计算，全国约1亿人携带乙肝病毒，其中乙肝患者约3000万。ELISA检测抗-HBc，抗_HBe抗体的原理是采用基因工程重组表迗的HBcAg、HBeAg包被固相反应板，加入标本的同时加入酶结合物，使待测标本中的HBcAb、HBeAb与酶结合物中的HBcAb、HBeAb公平竞争结合固相反应板上的HBeAg、HBeAg,形成”抗体-抗原-抗体”结构的免疫复合物。临床上检测乙肝两对半均采用手工加样，日常工作中是存在标本加样越多，加样时间越长，加酶时间月晚，这样势必存在着先加入的血清较长时间与固相上的H

7、BeAg,HBeAg结合，与酶结合物形成明显的时间差，造成假阳性；其二，由于在制备工艺上存在至今尚未解决的问题，使纯度受到影响，尤其是存在交叉反应、干扰物质的标本，在延时加入酶结合物情形，造成非特异性干扰，使假阳性增多。加样后多长时间再加入酶结合物就可出现假阳性？假阳性率多少？本次试验证实，加样后室温放置5min，再加入酶结合物，就可出现7%〜11%假阳性;加样后室温放置30min,再加入酶结合物，可出现48%〜55%假阳性。一个熟练的检验工作者进行150