实验五耐高温酵母菌株的诱变选育

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1、实验一耐高温酵母菌株的诱变选育一、目的要求通过实验，观察紫外线对酵母菌的诱变效应，学习物理因素诱变冇种的方法。二、基本原理紫外线对微生物冇诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/十方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作力相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的吋间成正比,故照射吋间的K:短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定

2、在＜30厘米〉左右，选用致死率达90〜99.9%所需的辐射时问进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需辐照3〜5分钟，芽孢耍10分钟，芽孢杆菌的营养体耍1〜3分钟，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30秒，放线菌的分生孢子用30秒〜2分钟。辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体屮进行，以免化学反应的干扰；同吋要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在尚液浓度较大或尚体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重耍。照射前紫外灯宜先丌灯预热20〜30分钟，使光波稳定。三.菌种与仪器菌种：酵母菌仪器：血球计数板

3、，敁微镜，紫外线灯（15W）,电磁搅拌器，离心机四.实验设计（1）菌悬液的制备（a）取培养24小吋的酵母菌的斜面1支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的大试管屮，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述阐液离心（1500r/min，离心5分钟），弃去上清液，将尚体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。(2)马铃薯琼脂培养基溶化后，冷至55°C左右时倒f•板，凝固后待用。(3)紫外线处理(a)将紫外线灯开关打开预热约20分钟。(b)取直径9cm无菌平皿1套，分

4、别加入上述菌悬液6—7ml，并放入无菌大头针于平皿中。(c)将盛冇菌悬液的1平皿置于磁力搅拌器上，在跑离为30cm,功率为15W的紫外线灯卜‘分别搅拌照射30s，60s,90s,120s,150s,180s。(4)稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成lO^-lO6(具体可按估计的存活率进行稀释)。(5)涂平板取1(T5、10_6、1(T7三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.lml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，静置

5、2min后，用黑布(或黑纸)傭，置36°C、42°C、50°C三个不同温度下培养24小时。注意每个平皿背而要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养24小时厄的平板取出进行计数，根据对照平板上菌落数，计算1.不同温度下菌的存活率2.不同紫外线处理时问茼的存活率3.同一温度下稀释倍数的准确性五.实验结采的观察与记泶存活率=处理后每鼍升活菌数对照每鼍升活菌数xioo致死率=对照每毫升活菌数-处理后每毫升活菌数对照每毫升活菌数X100将实验结來填入表8六.思考题(1)用于诱变的菌悬液(或孢子悬液)为什么要充分振荡？(2)经紫外线处理后的操

6、作和培养为什么要在暗处或红光下进行?-ss倍数^理时STw^）温度10'510'6107存活率％致死率％36°C0（对照）30609012015018042°C0（对照）30609012015018050°C0（对照）306090120150180