原核表达实验流程

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1、原核表达流程:第一步DH5a感受态制备DH5a感受态细胞目的基因获取IPCR扩增pGEM-T载体——重组载体1^转化转化细胞1I抽取质粒进行电泳j酶切验证检验阳性（阳性）转化细胞1

2、酶切，获取0的基因Pet28a/DH5a载体——重组载体2第二步重组载体2DH5a感受态细胞转化Z转化细胞2I抽収质粒进行电泳j酶切验证检验阳性（阳性）转化重组载体3BL21感受态细胞一j转化细胞3I诱导表达蛋白质提取ISDS-PAGE电泳检测呈阳性目的蛋白一.感受细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞j能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的

3、能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaC12法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaC12感受态细胞。木实验制备的足电转化感受态细胞。实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。(109〜lO'^^/ugDNA)实验材料：LB培养基(根据需要确定配制的量〉：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，加水至1000ml,高压灭菌

4、，保存在室温。无抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量)：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml,高压灭菌；铺平板，冷却后在37°C培养24小时，保存在室温。10%甘油：10ml甘油加入90m1ddH2O水，混匀，高压灭菌。其他：DH5a大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100mlLB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。实验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4°C离心机等。实验方法(1)将

5、大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗的LB平板划线，37"C培养箱过夜培养(培养好的平皿放入4°C冰箱贮存备用)。(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37°C振荡培养过夜；。(3)按照1:50比例接种过夜菌液至50mLLB培养基中，37°C剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4;(4)当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴15〜30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。(为获得最大效率的转化，在整个操作过程屮歯液的温度不超过4°C是关键，以下步骤务必在

6、超净工作台和冰上操作)(5)将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中，4°C用JA转头(或与之相当的转头)以2500rpm/min离心I5min,以回收细胞。倒去培养液，用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。(6)4°C用JA转头(或与之相当的转头)以2500rpm/min离心20min,以冋收细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘汕有保存细胞的作用)(7)4°C用JA转头(或与之相当的转头〉以2500rpm/min离心20min，以M收细胞。倒去培养液，用ImL冰冷的10%甘油重悬沉淀。(倾倒培养液吋要小心，10%甘油中的细菌沉

7、淀附着力降低。)(8)将细胞按40UL等份装入微量离心管，直接使用或-80'C保存(9)感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，37°C培养12—16小时，观察感受态细菌是否有污染；(10)取IPg超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没有必要精确计算，可用根据经验佔计)。注：以上操作全部在无菌条件rc冰浴下进行。技术要点1）无菌操作；2）原始菌种要保证质量；3）感受态细胞分装保存时不宜体积太大；4）细菌活化之后，生长密度最好保证OD600为0.4-0.6;5）冰上分装感受态细胞；6）在一

8、80°C保存感受态细胞，至少半年仍然可有较好的转化效率，但也不宜过久;7）防止携带某种质粒的其它细菌污染；8）防止其它杂菌污染。一.DNA连接和转化基本原理T4DNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，W催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验屮，将克隆载体pGEM-T与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入pGEM-T质粒中，构建外源DNA的克隆裁体。质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴

9、定目的克隆。电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对