原核表达（原理、材料和实验方案）

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1、原核表达（原理、材料和实验方案）一、原理1、E.coli表达系统E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、材料1、诱导表达材料(1)LB（Luria—Be

2、rtani）)培养基酵母膏(Yeastextract)5g  蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g  琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilledwater)  1000ml  pH7.0适用范围：大肠杆菌(2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，－20℃保存。(3)l×凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/L  Tris-CI(pH6.8)50mmol/L   DTT2% SDS（电泳级）0.1％ 溴酚蓝10％  甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1）酶溶法（1）裂解缓冲液：50mmol/L   Tr

3、is-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI（2）50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。（3）10mg/mL溶菌酶。（4）脱氧胆酸。（5）1mg/mLDNaseI。2）超声破碎法(1)TE缓冲液。(2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100mmol/L  Tris-HCI(pH8.0)100mmol/L  DTT4%SDS0.2％ 溴酚蓝20％  甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达(1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。(3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒D

4、NA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行下一步。(4）如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。(5）取上述培养液1mL,1000g离心，1min，沉淀，加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS-PAGE检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1）细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化

5、学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：①4℃，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。②每克菌加8μLPMSF及80μL溶菌酶，搅拌20min；边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸（在冷室中进行）。③37℃，玻棒搅拌，溶液变得

6、粘稠时加每克菌20μLDNaseI。室温放置至溶液不再粘稠。（2）超声破碎法。声频为15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。①收集1L诱导表达的工程菌，40℃，5000rpm离心，15min；弃上清，约每克湿菌加3mLTE缓冲液。②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10000g离心，15min，分别收集上清液和沉淀。③分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等

7、因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3-4次冻溶后更容易破碎。2）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。（1）试剂与配制①洗涤液I：0.5%TritonX-10010mmol/L  EDTA(pH8.0)溶于细胞裂解液中。②2×凝胶电泳加样缓冲液。（2）细胞裂解混合物12000g离心，15min,4℃；