原核表达实验流程.doc

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1、原核表达流程：第一步目的基因获取DH5a感受态制备PCR扩增pGEM-T载体重组载体1DH5a感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化细胞1酶切，获取目的基因Pet28a/DH5a载体重组重组载体2第二步重组载体2DH5a感受态细胞转化转化细胞2抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化重组载体3BL21感受态细胞转化细胞3诱导表达蛋白质提取SDS-PAGE电泳检测呈阳性目的蛋白一.感受细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化

2、子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。(109～1010转化子/μgDNA)实验材料：LB培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。无抗生素LB琼脂糖

3、平板培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。10％甘油：10ml甘油加入90mlddH2O水，混匀，高压灭菌。其他：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100mlLB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。实验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃离心机等。实验方法(1)将大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗的LB平

4、板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用）。(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；。(3)按照1:50比例接种过夜菌液至50mLLB培养基中，37℃剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4；(4)当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴15~30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中菌液的温度不超过4℃是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作）(5)将细菌培养物转移至冰冷

5、的50mL离心管中，4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。(6)4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存细胞的作用）(7)4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）(8)将细胞按40μL等份装入微量离心管，

6、直接使用或-80℃保存(9)感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；(10)取1μg超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没有必要精确计算，可用根据经验估计)。注：以上操作全部在无菌条件4℃冰浴下进行。技术要点1）无菌操作；2）原始菌种要保证质量；3）感受态细胞分装保存时不宜体积太大；4）细菌活化之后，生长密度最好保证OD600为0.4-0.6；5）冰上分装感受态细胞；6）在－80℃保存感受态细胞，至少半年仍然可有较好的转化效率，但也不宜过

7、久；7）防止携带某种质粒的其它细菌污染；8）防止其它杂菌污染。二.DNA连接和转化基本原理T4DNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中，将克隆载体pGEM-T与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入pGEM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电

8、穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。实验材料质粒DNA，pG