免 疫 组 织 化 学

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1、免疫组织化学Immunohistochemistry(IHC)第一章免疫组织化学基本原理及相关知识用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。蛋白质磷脂多肽多糖核酸受体酶病原体激素免疫组织化学技术的突出优点：●高度的特异性●敏感性高●方法步骤统一●机能和代谢密切结合，定性、定位、定量的统一免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研

2、究与诊断，开拓了广阔的前景。●基因探针●核酸分子杂交技术●原位PCR技术●核酸杂交和免疫组织化学双标记●电镜杂交技术核酸分子探针-杂交-免疫组织化学放大和显示杂交信号杂交免疫组织化学基因重组技术免疫组织化学图像分析单抗技术技术流式细胞术激光共聚焦显微术免疫组织化学的全过程：抗原的提取和纯化免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）抗体效价检测和提取、纯化标记抗体细胞、组织切片标本的制备免疫组织化学反应和显色观察和记录结果第二章免疫组织化学中的技术问题技术问题的重要性第一节有关的细胞和组织学技术一、取材（一）细胞标本的取材●印片法●穿刺吸取涂片法●体液沉淀涂片法细胞数量多：直接涂片细胞数量少：离心沉淀

3、涂片●培养细胞直接收集培养液离心涂片（二）组织标本的取材◆活检钳的刀口必须锋利，以免组织受挤压◆取材部位必须是主要病变区◆必须取病灶与正常组织交界处◆必要时取远离病灶区的正常组织作对照新鲜组织♥冰冻切片♥液氮保存♥-70℃冰箱二、固定固定剂：常用醛类固定剂◎10%福尔马林（甲醛10ml+蒸馏水90ml）◎10%中性缓冲福尔马林（甲醛10ml+0.01mol/LpH7.4PBS90ml）◎2.5%戊二醛用于电镜◎丙酮用于冰冻切片、细胞涂片4℃固定方法：▲浸入法▲灌注法三、切片1.石蜡切片2.冰冻切片3.塑料切片4.超薄切片四.玻片处理和涂胶载玻片和盖玻片处理盖玻片、载玻片清洁液中浸泡24h（

4、硫酸+重铬酸钾）清水冲洗蒸馏水冲洗95%酒精浸泡24h烘干载玻片涂粘附剂:APES多聚赖氨酸第二节免疫组化染色中的技术问题一、抗体新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。1.抗体贮存2.抗体稀释按不同的免疫染色方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。◆抗体最佳稀释度的测定方法————————————————————————二抗一抗11:501:1001:2001:400________________________________________________1:50+++++++++—1:100++++++++—1:

5、200++——1:400————________________________________________________◆以中等阳性稀释度为佳◆抗体稀释液的配制0.01mol/LpH7.4PBSorTBS3．抗体的选择(1)多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。(2)单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。多抗？单抗？抗原表位的丰富程度也可应用多个单抗（acocktailofmonoclonalantibodies）解决抗原

6、表位少的问题二、免疫染色一般程序：●标记抗体与标本中的抗原反应结合●用PBS洗去未结合的部分●直接观察结果（免疫荧光）或显色后再用显微镜观察（免疫酶）1.增强特异性染色的方法●蛋白酶消化法胃蛋白酶、胰蛋白酶●合适的抗体稀释度第一抗体●温育时间37℃30-60min,4℃过夜●多层染色法（双层、三层）2.减少或消除非特异性染色的方法加二抗动物的正常血清2%～5%牛血清白蛋白3.显色反应的控制显色剂的浓度、温育时间4.复染三、对照阳性对照阴性对照阻断试验替代对照空白对照自身对照吸收试验四、免疫组织化学染色结果的判断●阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞核、细胞膜表面●阳性细胞分布可分为灶性或弥

7、漫性●由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一●阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。●切片边缘、刀痕或皱折区域、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。第三章免疫组织化学常用方法介绍第一节免疫酶细胞化学免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原／抗体）在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体