《疫组化实验》PPT课件

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1、免疫组织化学实验课计划赵坤庆赵清杰中国科学院动物研究所Email：zhaokq@ioz.ac.cnzhaoqingjie11@mails.gucas.ac.cn实验一实验动物取样、固定与保存（4学时）实验室规章制度及实验室安全讲解学生分组分小组配置相关溶液：操作动物的致死法及取材:操作细胞标本的制备：操作尸体解剖的取材：讲解活检标本的取材：讲解组织样品的固定：操作实验室规章制度及实验室安全⑴熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。⑵检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。⑶工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，

2、不得盲目操作。⑷不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。⑸必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。⑹熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。⑺保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。⑻实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。⑼离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。⑽遇试剂溢出，应当立即清除。如溢

3、出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。⑾保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。⑿做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。⒀及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。⒁实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。⒂工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险的场所。学生分组1学生分为6组，每组3个人，每组选一个小

4、组长2安排值日生分小组配置相关溶液1配制10XPBS及1XPBS10×PhosphateBufferedSolution（PBS）(pH7.4)：ReagentWeightFinalconcentrationNaClMW=58.4481.816g1.4MKClMW=74.552.01g27mMNa2HPO4·12H2OMW=358.1435.8g100mMKH2PO4MW=136.092.45g18mMH2OUpto1000ml注：1000ml溶液用约1ml10MNaOH调节pH值至7.4。因为实验室所用蒸馏水、三蒸水和去离子水的本底p

5、H值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。2配制1NHCl，1NNaOH3配制组织固定液：4%PFA4配制热修复液：Tris-EDTA5配制梯度酒精：75%，85%，95%6酒精：二甲苯=1:17石蜡：二甲苯=1:1分小组配置相关溶液动物的致死法动物处死方法：1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥静注2.空气栓塞法3.断头法4.断颈法5.二氧化碳窒息法病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。尸检组织的取材抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病

6、灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。手术切除标本的取材1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定4.组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织取材注意事项培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将（1）细胞大量

7、培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。活细胞标本的制备法目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞

8、过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织标本的固定(1)甲醛固定液10％福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良Bouin