形态学试验常用试剂配置方法.doc

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1、形态学试验常用试剂配置方法4%多聚甲醛多聚甲醛4g，加蒸馏水100ml，加热至60℃，搅拌并加入1MNaOH数滴，调pH至7.0，滤纸过滤，现配现用。0.01MPBS缓冲液氯化钠(NaCl)8.50g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)3.58g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.39g加双蒸水至1000ml1MNaOH调整pH至7.2-7.4，室温存放。一袋独立包装的PBS（2000ml）加2000ml蒸馏水溶解。0.01mol/L枸橼酸缓冲液柠檬酸0.2g柠檬酸三钠1.5g加双蒸水至500ml1MN

2、aOH调整pH至6.0，现用现配。铬矾明胶液铬矾0.5g明胶5g蒸馏水1000ml以500-800ml蒸馏水加温溶解明胶，待其完全溶解后加入铬矾，最后加蒸馏水至1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸馏水洗，烤干，包被时水温不超过70℃。DAB试剂的配制（以DAB试剂盒为例）在1.5mlEP管内加入1-1.5ml蒸馏水，加入一滴试剂A，混合均匀，然后将试剂B和试剂C各一滴加入其中，再次混匀。此溶液必须现配现用，配好后避光保存，30分钟内使用，剩余的液体应弃去。石蜡切片的制备1.组织块从固定液中取出，流水冲洗

3、1-2h2.脱水：70%酒精→80%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→无水酒精Ⅰ→无水酒精Ⅱ，各级酒精浸泡30min-1h。3.透明：彻底脱水后的组织经苯Ⅰ→苯Ⅱ，各浸泡30mim-1h。4.浸蜡：完全透明的组织放入56-58℃石蜡中2-3h。5.包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。6.切片：旋转式切片机将蜡块切成5-10μm薄片，贴在经铬矾明胶处理的载玻片上。7.58-60℃烤片2-4小时。冰冻切片的制备1.组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底（大约需要12-2

4、0小时）；2.0.01MPBS缓冲液冲洗，5min；3.放入冰冻切片机内进行冰冻固定4.待组织快固定好后行连续冰冻切片，片厚5-20μm，放入-20℃冰箱内保存。免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01MPBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.

5、01MPBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01MPBS冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01MPBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30min，0.01MPBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30min，0.01MPBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01MPBS终止显色；10．梯度酒精

6、脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60min，0.01MPB

7、S冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。(7)荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。2．在含0.1%TritonX-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3．羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，

8、于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。5．去除一抗后，细胞用PBS洗三次。6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟。7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。8．DAB避光显