钾电流在甲基苯丙胺引起神经元损伤中作用

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1、钾电流在甲基苯丙胺引起神经元损伤中作用DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.11.007基金项目：国家自然科学基金面上项目（81072329）；国家自然科学基金青年基金（81202230）；南京医科大学科技发展基金（2011NJMU275）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（JX10231801）作者单位：210029南京，江苏省人民医院急诊科（蒋雷、张劲松）；南京医科大学（王军、高蓉、肖杭）；蒋雷、王军对本文贡献度相等通信作者：张劲松，Ema订：Zhangjso@sina.com【摘要】目的探讨甲基苯丙胺（Meth）对外向钾电

2、流的影响及外向型钾通道在Meth引起的海马神经元损伤过程中的作用。方法以分离出的怀孕18dSprague-Dawley大鼠胎鼠的海马神经元作为实验对象，分为对照组和Meth处理组，采用全细胞膜片钳的实验方法，分别记录Meth处理后外向4-AP和TEA敏感型钾电流大小的变化。通过MTT和TUNEL的方法，观察Meth作用后引起的电流变化对海马神经元活力和凋亡的影响。统计分析利用单因素方差分析结合LSD-t检验，以P[Keywords]Methamphetamine；4~APsensitiveK+channel；TEAsensitiveK+channel；Cellapop

3、tosis；Hippocampalneurons甲基苯丙胺（Meth）俗称冰毒，因其易制、低价，吸食后欣快感持续时间长等特点在毒品吸食人群中"广受欢迎”[1]。中枢神经系统是Meth作用的重要靶器官之一,Meth的滥用会引起一系列神经系统性障碍，导致学习记忆注意力和决断能力的下降甚至缺失[2-3]o影像学研究表明，长期使用Meth会导致脑灰质部分细胞的缺失，海马萎缩以及脑白质小胶质细胞的激活，但其机制仍不明确[4-5]o越来越多的研究表明，钾离子通道对细胞体积的维持起重要作用。钾离子的持续性外流会引起细胞的皱缩，最终导致细胞凋亡[6-7]o对甲基苯丙胺与钾通道关系的

4、研究，国内外鲜有报道。因此，基于以上钾离子通道在维持细胞体积中的重要作用结合Meth引起海马萎缩这一现象，在本研究中，笔者以钾离子通道作为研究靶点，探讨甲基苯丙胺对外向钾电流的作用，阐述钾离子外流与神经元凋亡损伤的因果关系，以期为Meth的干预提供新靶点和依据。1材料与方法1.1细胞、试剂与溶液清洁级18dSD孕大鼠由南京医科大学实验动物中心提供。HBSS缓冲液购自cellgro（美国），2.5%的胰酶购自HyClone（美国）,兔抗大鼠MAP-2抗体购自ChemiconC美国）,AlexaFluor-594标记的羊抗兔二抗来自Invitrogen（美国），TUNEL

5、试剂盒（InsitucelldeathDetectionKit,Fluorescein）购自Roche（美国），荧光包被液（含DAPI）购自VECTOR（美国）。DNAse（2000U/mL）、MTT、Methamphetamine＞钾离子通道抑制剂4-AP、TEA均购自Sigma（美国）。无血清培养液中Neurobasalmediuni、B27、青链霉素（100U/mL）、胎牛血清均购自Gibco（美国），谷氨酰胺（0.5umol/L）购自Sigmao电极内液（mmol/L）：K-gluconate120,KC110,NaCl5,CaC121,MgC122,EGTA

6、11,HEPES10,Mg-ATP2,GTPloKOH调节pH值至7.3o电极外液（mmol/L）：NaCl140,KC15,CaC122.5,HEPES10,glucose10,TTX1nmol/LoNaOH调节pH至7.3,渗透压为300〜310mOsm（1m0sm/L=2.57kPa）o以上内外液所有成分均购自Sigmao1.2海马神经元的分离和鉴定1.2.1海马神经元的分离参照姜骏等［15］的方法，略有改进。小心取出海马组织，置于冰浴的HBSS液中；吹打使其初步分开；加入2.5%的蛋白胰酶1mL,同时加入100□L的DNAse,用HBSS稀释10倍后37°C消

7、化15〜20min,以胎牛血清中和，吹打细胞，使其充分分离，离心；细胞取出后加入HBSS液，吹打使细胞分离，先后经100um和40um网筛过滤。离心，弃上清，加入5mL培养液，吹打使细胞悬浮。计数，以适当密度接种于培养皿中，每3d进行细胞的换液。1.2.2海马神经元的鉴定利用兔源性抗大鼠神经元特异性标志物MAP-2的抗体与细胞4£孵育过夜，然后加入AlexaFluor-594标记的羊抗兔二抗，最后滴加防荧光猝灭含DAPI复合染料。神经元的纯度二MAP-2红染细胞数/DAPI蓝染细胞总数X100%o1.3电极制备记录用的微电极用硼化玻璃毛细管（内径1.