临床医学毕业论文银杏内酯b对胆固醇和载脂蛋白e4损伤海马神经元胆固醇代谢的影响

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1、银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元胆固醇代谢的影响姓名：2014年6月25日银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元胆固醇代谢的影响作者：姜希娟郭茂娟苏金玲薛洁张瑞峰马轶文王强范英昌【摘要】0的探讨银杏内酯B对高胆固醇和载脂蛋白E4(ApoE4)损伤海马神经元胆固醇代谢的影响。方法应用40

2、ig/ml胆固醇和30

3、ig/mlApoE4联合处理海马神经元，模拟高胆阎醇细胞损伤模型。银杏内酯B对此模型进行干预后，经实时定量聚合酶链反应(RTPCR)的方法分别测定低密度脂蛋白受体蛋白(LRP)lmRNA、三磷酸腺苷结合盒转子A(ABCA)mRNA和内质网乙酰胆固醇酰基转移酶

4、(ACAT)mRNA的表达，采用蛋白印迹法分别检测LRP1、ABCA1和ACATI蛋白的表达。结果模型组上调LRP1mRNA表达，对ABCA1和ACATImRNA的表达有上调趋势，但是与对照组相比无显著差异。银杏内酯B可以有效上调ACAT1mRNA的表达，与模型组相比差异显著。上述因子蛋白的表达与mRNA表达趋势相一致，而且模型组与各组相比均有显著差异。结论胆固醇和ApoE4联合作用影响神经元胆固醇的摄入、细胞内胆固醇转化和胆固醇的排出。银杏内酯B对高胆固醇环境下神经元胆固醇代谢有一定的调节作用。【关键词】胆固醇;银杏内酯B;低密度脂蛋白受体相关蛋白1;ATP结合盒转运蛋白1;脂酰胆固

5、醇酰基转移酶1大量研究表明脑胆固醇代谢异常在阿尔茨海默病(AD)发病过程中发挥重要作用，特别在载脂蛋白E4(ApoE4)亚型占优势的人群，这一作用尤为突出〔1)。由于血脑屏障的存在，脑胆固醇代谢主要在局部进行，受外周胆固醇水平影响甚小，而AD发病的主要部位集屮在海马组织。因此，直接观察胆固醇与ApoE4协同作用下，海马神经元胆固醇如何代谢有着重要意义。海马神经元胆固醇的水平主要依赖于胆固醇摄入、细胞内转化和逆向转运是否平衡;上述过程关键酶的变化是影响胆岡醇代谢的重耍因素。银杏内酯B是银杏叶的主要成分，具有明确降低外周胆固醇作用，同时也是防治AD的常用药物，但是其防治AD的机制是否与调节

6、海马神经元胆固醇代谢有关尚不清楚〔2)。因此，本文拟观察高胆固醇和ApoE4联合作用下，离体观察海马神经元局部胆固醇代谢相关关键酶的变化以及银杏内酯B对其是否具有调节作用，阐明银杏内酯B防治AD的分子机制。1材料与方法1.1药品与试剂银杏内酯B,分子式C20H24010,天津中一药厂从银杏叶中提取(纯度90%以上)。DMEM/F12培养基，B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Invitrogcn),多聚L赖氨酸、PenicillinStrcptomycin(Sigma),PowerSYBRGreenRTPCRReagentsKit试剂盒(Appliedbiosystems)，内

7、质网乙酉先胆固醇酰基转移酶(ACAT)l—抗sc21029、ABCA1—抗Sc5490、低密度脂蛋白受体蛋白(LRP)l—抗sc18823、相应二抗(SantaCruz),其余试剂均为市售分析纯。1.2实验动物18KW新生24h内SD大鼠，体重约10g,由天津药物研究院实验动物中心提供。1.3其他实验材料CO2培养箱(SANYO),超浄化工作台(HITACHI),IX70型倒置显微镜(Olympus),ABI7300实时定量聚合酶链反应(RTPCR)仪等。1.4海马神经元原代培养与鉴定新生24hSD大鼠，无菌条件下取脑，剔除脑膜和血管，分离出双侧海马，置于DHanks中清洗2遍。经眼科

8、剪充分剪碎后，用尖端已被火焰抛光的弯头吸管充分吹打后过75pn组织筛网，将滤过液移入离心管中1000r/min离心10min。弃上清，用含2%B27,20pig/LbFGF添加剂和1%双抗的DMEM/F12重悬沉淀后计数，以5xl05/cm的密度种植于事先用L多聚赖氨酸包被的培养板。24h后全量换液，以后每3d半量换液。采用神经元特异性烯醇化酶免疫荧光法进行鉴定。1.5药物剂量的确定银杏内酯B剂量的确定采用噻唑蓝(MTT)比色法。选择最高吸光度药物浓度160

9、ig/ml作为实验剂量。1.6分组与给药采用无血清培养基培养海马神经元至4d,弃掉无血清培养基，依据文献〔3〕加入含40

10、ig/

11、ml胆冏醇和30

12、ig/mlApoE4的无血清培养基作用24h，作为模型组;始终采用无血清培养基培养的，不做任何处理的作为对照组;正常无血清培养基培养至3d，加入160gg/ml银杏内酯B作用16h后，于第4天再加入含40gg/ml胆固醇和30gg/mlApoE4的无血清培养基继续作用24h，作为银杏内酯B组。共三组，每组6只大鼠。1.7RTPCR测定胆固醇代谢相关基因的表达采用Trizol试剂提取神经元总RNA。依试剂盒说明书，采用TaqMa