冬虫夏草菌群体遗传学及其与寄主昆虫之间的进化关系研究

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1、冬虫夏草菌群体遗传学及其与寄主昆虫之间的进化关系研究【摘要L冬虫夏草是我国传统的名贵珍稀中药，是由冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis)侵染青藏高原高111草甸土中的蝙幅蛾幼虫(鳞翅目蝙蝠蛾科)而形成的僵虫与子座的复合体。由于具有独特的药用价值，加上野生资源不断减少、市场价格飙升，冬虫夏草受到国内外各界人上的关注，也成为近年科学研究的热点。然而，冬虫夏草的规模化人工栽培一直没有实现。冬虫夏草菌与其寄主昆虫在长期的进化过程中形成严格的专性寄生关系，但由于缺乏冬虫夏草菌与寄主昆虫之间进化关系的系统研究，在冬虫夏草人工栽培实践中，人们并没有重

2、视冬虫夏草菌和寄主昆虫的地理来源问题,这己影响到冬虫夏草的产业化进程。本论文首先选择代表性产地广泛采集冬虫夏草样品；通过构建shotgun基因组文库筛选冬虫夏草菌多种高效的分子标记，同时选择寄主昆虫适宜的多基因标记；利用分子群体遗传学方法分析冬虫夏草菌与寄主昆虫的遗传结构；根据冬虫夏草菌与寄主昆虫多基因序列分析的结果，分析冬虫夏草菌与寄主昆虫之问的进化关系。研究结果不仅从分子水平上为冬虫夏草菌与寄主昆虫的分类、演化和协同进化关系的建立等科学问题提供理论证据，而且对冬虫夏草的资源保护及人工规模化培育具有重要的意义。本研究取得的主要结果如下：1)从西藏、青海、

3、四川、云南、廿肃等地采集了900多枚冬虫夏草样品，并从中分离了59个冬虫夏草菌株。所分离的菌株经形态学和分子序列验证，全部力中国被毛孢Hirsutellasinensis，即冬虫夏草菌的无性型。2）利用冬虫夏草菌株YN07-8构建了shotgun基因组文库。从所构建的文库中随机挑选约260个克隆进行测序，并从所测序列中选择约30条序列（以OSRC起始命名）设计PCR扩增引物。用设计的引物从4个地理距离较远的冬虫夏草样品中扩增相应的基因。通过对这些基因片段在4个不同样品问核苷酸多态性的比较，找出碱基变异较大的基因片段（如OSRC14、OSRC32）用于后面冬

4、虫夏草菌群体遗传学的研宄。3）以121个冬虫夏草样品为材料，使用7个分子标记基因（nrDNAITSMATl-2-l、cspl、OSRC14、OSRC17、OSRC27和OSRC32）分析冬虫夏草菌的群体遗传结构。研究发现，冬虫夏草菌不但在地理种群内而且在地理种群问都表现出明显的遗传分化。西藏南部种群具有最高的遗传多样性，可能是冬虫夏草菌的起源中心。冬虫夏草菌的遗传分化程度随纬度梯度的增加而增加,而与经度和海拔的相关性不强。分子钟和生物地理演化分析的结果显示，冬虫夏草菌可能于22.59百万年前（22.59Mya）起源于西藏南部地区，在此后的进化历史中不断向青

5、藏高原其他地区扩散，而且该过程伴随着多种进化事件的发生。4）以冬虫夏草菌群体遗传学研究中使用的相同冬虫夏草样品为材料,从由天然冬虫夏草的僵虫部位提取的基因组DNA中扩增寄主昆虫的基因片段。我们共选择了3个分子标记基因（COI、cytb和wingless）分析寄主昆虫的遗传多样性和遗传结构。研究发现，寄主昆虫具有较高的遗传多样性，在地理群体内部和地理群体之问都存在遗传分化。寄主昆虫的遗传距离与水平地理距离呈正相关性，而与海拔距离之间没有明显相关性。冬虫夏草菌寄主昆虫可能6百万年前（6Mya）起源于论文发志专家西藏南部地区，由此向其他地区扩散。5）冬虫夏草菌的

6、遗传距离与寄主昆虫的遗传距离之间具有显著的正相关性。然而，冬虫夏草菌和寄主昆虫之间除共进化事件外，还有多次的跳跃事件，即一种真菌单元型可以对应不同的昆虫单元型，一种昆虫单元型可以对应不同的真菌单元型。【关键词】：冬虫夏草菌蝙蝠蛾昆虫群体遗传学分子标记协同进化【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：S567.35【目录】：目录4-6Contents6-8中文摘要8-10ABSTRACT10-13第一章引言13-191.1冬虫夏草简介13-141.2冬虫夏草的分布与资源14-151.3冬虫夏草菌的寄主范围15-161.

7、4人工栽培及产品产发161.5冬虫夏草菌群体遗传学研宄进展16-171.6木研究的目的和意义17-19第二章冬虫夏草样品采集、菌株分离及DNA提取19-242.1材料与方法19-212.1.1冬虫夏草样品采集192.1.2冬虫夏草菌株的分离和培养19-202.1.3冬虫夏草DNA提取202.1.4基因扩增20-212.2结果21-232.2.1冬虫夏草样品采集和菌株分离21-222.2.2冬虫夏草DNA提取22-232.3讨论23-24第三章冬虫夏草菌分子标记的筛选24-413.1材料与方法24-253.1.1菌株243.1.2shotgun基因组文库构建

8、24-253.1.3文库中克隆的测序和BLAST分析253.1.4