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《伤寒沙门菌株耐药性与vipr基因rflp和pfge分型研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、伤寒沙门菌株耐药性与vipR基因RFLP和PFGE分型研究肖群(解放军九四医院检验科330002)【摘要】目的:监测伤寒沙门菌株对青霉素和其他抗生素的耐药情况。分析多重PCR基因扩增产物图谱与青霉素耐药性的相关性，分析血清型青霉素耐药菌株的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)图型，初步了解耐药菌株分子流行病学上的特点。方法:(1)抗牛.素药物敏感试验；(2)用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)结果发现23株多重耐药鼠伤寒沙门菌,其中耐4〜5种抗生素的9株(40%),耐6〜9种抗生素的8株(35.13%),耐10种抗生素的6株(2
2、6.10%);可分为16个PFGE型，其中5个PFGE型的菌株数超过1株。结论：伤寒沙门菌分离株的多重耐药性严重,PFGE分型方法对鼠伤寒沙门菌的分型能力较好。【关键词】伤寒沙门菌;抗药性;微生物;聚合酶链反应;电泳;凝胶;脉冲场【中图分类号】R378.24【文献标识码】B【文章编号】1008-6455(2010)09-0043-02近年来，细菌的耐药性已经成为一个非常普遍的现象，引起各岡食品安全和医药工作人员的高度关注。，且由于目前抗生素的滥用等情况，故常被误诊为感冒、胃肠炎等疾病，误诊率较高。因此病原菌准确的鉴定及药敏试验非常重要。1材料和方法1伤
3、寒沙门菌药物敏感试验1.1伤寒沙门氏菌株的采集、分离和鉴定：1.1.1标木来源：我院2007年送检的血培养标木中培养出的57例伤寒沙门菌1.1.2镜检与培养：标木直接涂片革兰染色镜检见革兰阴性杆菌，同时接种在血平板和中国兰琼脂平板上，36°C,24h培养后观察，血平板上菌落直径约2mm-3mm圆形，光滑，湿润，不溶血；在中国兰琼脂平板上菌落无色，光滑，稍隆起，较透明，直径约种培养基上均为纯培养，革兰染色为阴性杆菌。1.1.3生化鉴定：0/F试验发酵型，氧化酶阴性，克氏双糖管底层产酸、斜面产碱、产H2S、动力阳性，可疑为沙门菌用法国梅里埃API20E系统
4、鉴定为沙门菌属，可信率99.9%。1.1.4血清学鉴定：沙门菌诊断血清系兰州生物制品研究所生产，A-FO多价凝集，04凝集，H凝集1.2.3.5,Hi凝集，该菌株符合鼠伤寒沙门菌。1.2抗生素药敏试验检测方法为琼脂扩散法即K-B法，平皿中M-H琼脂定量加人，确保培养基厚度为4mm,至少挑选3-5个相同菌落接种在4-5ml适宜的肉汤中，置37°C培养2-6h，直至其浊度达到或超过0.5麦氏单位，超过者可用生理盐水稀释校正至0.5麦氏单位，在校正后15min内，以无菌棉试蘸取并在管壁内轻轻挤去多余的菌液后涂布整个平皿琼脂表面，交叉涂布2-3次，使接种均匀，
5、然后放置室温3-5min后贴加药敏纸片，但不应超过15min，轻压纸片使与琼脂表面完全接触，相邻纸片中心至少相距24mm，贴完纸片后15min内，平皿应倒置放人35.9°C孵箱培养，16-18h判读结果。13结果判定:根据美国国家实验室标准委员会(NCCLS)2000年版抗生素敏感试验标准(M1002S10)。1.4质盘控制：每周做一次质控，确保菌株鉴定及药敏结果的准确性。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923,大肠埃希氏菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。均由卫生部临床检验中心供应，每月更换1次。1.5统计学处理:χ2检
6、验、在SPSS(IO.O)统计软件下分析数据,P<0.05吋差异有显著性。2聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)2.1PCR引物购自上海生工生物工程公司：上游引物GGTTTCATCATTTCAGGCCTCCA下游引物CTCTGCTCCGTCAAGATCTTTTCACC2.2PCR仪:PTC-100′TMProgrammableThermalController(MJResearchInc.)2.3PCR流程:—•接种环的伤寒菌加到300μl的0.85%盐水中,94°C孵育5min,离心去上清，加入5
7、0μITE缓冲液和10U互构酶,37°C孵育lOmin。然后加热到100°C,3min。取2μl粗制伤寒菌溶解物为模板，加入引物、MgCI2、dNPT、×10缓冲液、TaqDNA聚合酶和蒸馏水,总反应体积为50μl。以94°C变性30s,56°C退火30s，72°C延伸1min,循环28次后,再延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，染色，紫外光下检测。2.4限制性内切酶消化反应:取5μl扩增产物加入3UHaein限制性内切酶,37°C孵育20min。取消化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，染色，紫外光下检测，判断结果
8、。3脉冲电场凝胶电泳分型(PFGE)3.1实验操作过程采用美国PulseNet标准操作手册(P
