动物细胞培养生物制药ii

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1、第10讲动物细胞培养生物制药II本节主要内容1.适合大规模培养的细胞系2.动物细胞培养的生物反应器3.微载体及其培养特点4.动物细胞培养的影响因素与培养工艺5.动物细胞的低温保存本节关键问题1.了解常用的大规模培养的动物细胞株特点2.了解适合动物细胞大规模培养的生物反应器3.重点掌握微载体培养技术4.了解动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺一适合大规模培养的细胞株1.细胞系(Cellline)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之为

2、细胞系。不能连续培养的为有限细胞系(Finitecellline)，能连续培养下去的为连续细胞系(Infinitecellline)。2.细胞株(Cellstrain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。毛细管法------形成单个细胞克隆的细胞群体有限稀释法3.适合工业化生产的细胞株包括：原代细胞、传代细胞有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理想的药物生产细

3、胞）二倍体细胞、异倍体细胞融合细胞、转化细胞、基因工程细胞贴壁型、非贴壁型（1）原代细胞鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、血液淋巴细胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进行生物制药的先河。具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等缺点。药物筛选、药理研究。（2）传代细胞二倍体细胞：具有正常细胞的特点：二倍体染色体、具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。有限细胞系（传代次数一般都不超过50代）。WI-38：1961年Wister38研究所从女性高加索人的正常胚

4、肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI-38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用于生产的二倍体细胞,对病毒敏感，第一个用于疫苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。MRC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。（3）转化细胞细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由有限性细胞系转化为连续性细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体，失去正常细胞的特点，开始时由于安全性不能确认而没有大量使用。随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细

5、胞于20世纪80年代获得批准用于生产。转化方法1.细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。CHO细胞(Chinesehamsterovarycell)：从中国仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。CHO细胞能表达糖基化蛋

6、白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(Tissueplasminogenactivator，tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（Granulocytecolonystimulatingfactor,GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。BHK-21细胞（Babyhamsterkidneycell）：是1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于

7、增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白(例如重组凝血因子VIII)。Vero细胞（Verocell）:是1962年日本从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。（4）融合细胞杂交瘤细胞：脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞。无血清培养基中高密度悬浮生长。抗体药物生产。二动物细胞大规模培养1962年开始大规模培养尝试，目前已经成为生物制药的重要支撑技术。疫苗、抗体、蛋白类药物等。（一）定义（二）转管/瓶培养系统转瓶培养是在转管培养

8、基础上为扩大培养量而改进的。转瓶或转管固定在旋转支架上，倾斜角度一般为5º-10º。细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。（三）动物细胞生物反应器培养除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，如贴壁、脆弱等，与微生物细胞培养不同，需要特别注