动物细胞培养技术

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1、动物细胞培养技术1.动物细胞的生长与培养动物细胞的特点进化程度高结构、形态、成分复杂细胞间连接形式多样生长相对缓慢功能全面1.1培养细胞的生物学特征Hepatocytes体外培养细胞的分型（一）贴附型成纤维细胞型上皮型细胞游走细胞型多形型细胞（二）悬浮型（三）半贴壁型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式结果:基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以

2、后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞细胞在体内、外的贴附方式：存在差异体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型1、成纤维细胞型：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或

3、不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起2、上皮型细胞：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突

4、起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：

5、纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离无菌无毒害的环境1支持生长增殖的营养2其它类似体内的环境3维持细胞性状41.2细胞培养总原则(一)细胞培养无菌无毒环境实验室设计合理常用设施及设备培养器皿：透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。细胞培养无菌操作基本技术工作环境及表面的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理培养液与培养细胞的处理(二)细胞的营养培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养

6、细胞生长和繁殖的生存环境。血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。其它成分（条件培养基）合成培养基的主要成分氨基酸碳水化合物无机盐维生素其它辅助物质培养基种类RPMI-1640（标准型）DMEM-高糖（标准型）DMEM-低糖（标准型）McCoys5AM199F12血清牛血清、马血清、人血清（1）储存于-20℃—-70℃低温冰箱中（2）一般厂商提供的血清为无菌（3）热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complement）灭活（4）血清中

7、的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理。其它常用液体试剂Hank’sD-Hank’sPBSNaHCO3（7.5%）胰酶溶液（0.25%）(三)其它类似体内的环境温度气体渗透压氢离子浓度(PH)其他(四)合理的计划，维持细胞性状尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞需要做实验的细胞要选对数生长期防止细胞污染，如遇污染，及时处理一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性

8、菌。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。