动物细胞培养生物制药i

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1、第9讲动物细胞培养生物制药I先看看人体的一些细胞免疫细胞白血球巨噬细胞歼灭癌细胞Ｔ细胞与Ｂ细胞树突细胞骨细胞成骨细胞胶质细胞视网膜视杆细胞黑色素细胞本节主要内容1.动物细胞培养的特点2.动物细胞培养的条件、方式3.原代培养、传代培养技术本节关键问题问题1：动物细胞体外生长特点问题2：动物细胞培养的培养基特点问题3：动物细胞原代培养方法问题4：动物细胞传代培养方法（一）动物细胞培养的特点1定义：动物细胞培养（Animalcellculture）是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。2历

2、史：1907年,哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔（Carrel）设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大推动了动物细胞培养技术的建立。1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养的培养基。伴随着培养工具与培养基的不断完善，动物细胞体外培养技术日益成熟。3应用领域生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白基础研究的细胞

3、材料：细胞模型种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子细胞4特点动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感。动物细胞生长缓慢，易受污染。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长。体外生长的动物细胞一般具有贴附、细胞接触性抑制、密度抑制的特点。悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物细胞中只有极少数细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，称之为悬浮型细胞。血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞

4、。贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在带适量正电荷的固体或半固体表面才能生长。属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：A成纤维细胞型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。B上皮型细胞类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”，局部可以单层的上皮状“膜片组织”。皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道

5、的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。C游走型细胞呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。D多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。接触性抑制(Contactinhibition)是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象（图11.

6、2）。由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。密度抑制(Densityinhibition)细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象（二）动物细胞培养的条件严格的无菌技术:细菌真菌支原体病毒交叉污染1.培养基对于营养要求非常苛刻，氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。包括：天然、合成、无血清培养基三种。（1）天然培养基动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等

7、。优点：营养价值高缺点：成分复杂、来源有限、成本较高血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。（2）合成培养基优点：成分已知，便于对实验条件进行控制。缺点：无法替代一些未知成分解决途径——合成培养基中添加小牛血清，彼此互补目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等.例如MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的无机盐，组成简单。DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培

8、养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培养。（3）无血清培养基血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点：（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用。（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。（3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产