快速pcr方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究

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1、快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究［摘要］该研究依据哈蟆油Cytb基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物，采用碱裂解法提取基因组DNA，2步循环PCR程序进行PCR反应，并对PCR反应条件进行优化，从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法。该方法在90°C变性3s，62°C退火延伸20s进行32个循环时，加入2(iLlOOxSYBRGreenI染料，正品显示出明亮绿色荧光，而混淆品不显示荧光。该方法准确、简便，40min内即可完成鉴别，为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持。［关键词］快速PCR;哈蟆

2、油；分子鉴定；荧光检测［Abstract］Rapidallele-specificPCRprimerwasdesignedbaseonCytb155A/Tsinglenucleotidepolymorphism，DNAwasextractedbyalkalinelysisandthePCRreactionsystemsincludingdenaturedandannealingtemperatureandcyclenumberswereoptimized.TheresultswereperformedtoauthenticateRa

3、naeOviductusandits4adulterants.WhenlOOxSYBRGreenIwasaddedinthePCRproductat90°Cdenatured3s，62°Cannealing20sand32cycle.RanaeOviductusvisualizedstronggreenfluorescenceunder365nmUVlampwhereasadulterantsappearednegative.Thewholeprocesscanbecompletedin40minutes.Theestablishe

4、dmethodprovidesthetechnicalsupportforauthenticationoftheRanaeOviductus.[Keywords]rapidPCR；RanaeOviductus；molecularauthentication哈蟆油RanaeOviductus为蛙科动物中国林蛙RanatemporariachensinensisDavid雌蛙的令卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，谤嗽咳血［1］。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导

5、致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4类，其他伪品类型少见［2-3］。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用［3-6］，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且

6、需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。近年来，快速PCR方法已成功用于金银花［7］，蛇类［8］，太子参［9］，人参、西洋参［10］等中药材的真伪鉴别，因此本项研究基于快速PCR方法对哈蟆油及其常见混伪品进行鉴别研宄，有效的提高哈蟆油鉴别反应效率，为哈蟆油药材的鉴别提供更加符合实际需要、简便快捷的方法。1材料与仪器1.1药材收集不同产地中国林蛙10批、黑龙江林蛙4批、黑斑蛙4批、中华大蟾蜍4批、牛蛙2批，哈蟆油3批，牛蛙油1批。所有基原动物按传统加工方法分别制成哈蟆油、黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、赡蜍油、牛蛙油，另选取哈蟆

7、油药材3批进行快速PCR方法研究。样品分别采自吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、山东、江苏、湖南、四川等地。经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定，凭证标本保存于哈尔滨市食品药品检验检测中心，见表1。1.2仪器S1000型梯度PCR仪；ETC811型PCR仪；22R型高速冷冻微量离心机；ZH-2型漩涡震荡器；MM400型球磨机；DYY-6C型电泳仪；310型凝胶成像系统，2000C型分光光度计。1.3试剂琼脂糖；GelRed购自Biotium公司；SpeedStarHSTaqDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、DL2000D

8、NAMarker购自TaKaRa公司；TransfastTaqDNA聚合酶购自Transgen公司，PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶购自Vazyme公司；SYBRGreenI购自Invitrogen公司；其他