rubisco活性的测定inbook植物生理学实验手册

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1、4-17二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)羧化活性的测定核酮糖-1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(EC4.1.1.39)是光合作用中的一个关键酶，它在Calvin循环中催化C02的固定，生成二分子的3-磷酸廿油酸(3-PGA)，同时它是一个双功能酶，乂能催化将02加在核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)的C-2位置上生成一分子的磷酸乙醇酸和一分子的3-磷酸廿油酸，这两个反应的速率由02和C02浓度调节。Rubisco駿化活性的测定一般通过测定从NaH14CO3生成酸稳定的[l-14C]-3-PGA的速率来进行，也可以用酶偶联法将3-PGA的变化转变为NADH来

2、测定。其原理如下：RuBP+CO2+H20Kubisco+Mg、2X3-磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸+ATP1，3-二磷酸甘油酸+ADP1，3-二磷酸甘油酸+NADH,■■麵默3-磷酸甘油醛+NAD++H+P0,3从以上反应计算一分子RuBP的羧化就有两分子的NADH被氧化，这样就可以用紫外分光光度计在340nm测NADH的减少来计算酶活力。1仪器设备液体闪烁计数器、烘箱、水浴锅、研鉢或组织捣碎机、分光光度计等2操作方法2.1Rubisco的提取及纯化2.1.1植物粗提液的制备称约Xg叶片加入Xml预冷到4°C提取缓冲液(Tris-HClpH7.8100mmol/L,K

3、C120mmol/L,EDTA1mmol/L)中匀浆，15000g离心10min取上清液备用。2.1.2酶的纯化将上述得到的粗提液用40%饱和度的硫酸铵进行分部，8000g，在4°C冷冻离心20min。然后取上清液加硫酸铵至70%的饱和度，10000g，冷冻离心20min后取沉淀，用少量重悬缓冲液(25mmol/LTris-HClpH7.8,1mmol/LEDTA,5mmol/L巯基乙醇，20mmol/LKC1)溶解，再经SephadexG-25脱盐后上DEAE(DE52)柱，用含0-0.5mol/LNaCl的重悬缓冲液进行梯度洗脱，收集0.25mol/LNaCl分

4、部。70%硫酸铵沉淀保存于-20°C，待测活性前以2mg/ml溶于重悬缓冲液中备用。2.2同位素测定法2.2.2酶活性的测定操作在460u丨测定反应液(Tris-HCIpH8.2100mmol/L,NaH14CO3(0.2nCi/umol)10mmol/L,MgCl220mmol/L,DTT1mmol/L)中,加入20ul酶液(2mg/ml),混匀后在25°C保温10-20min,加入20ulRuBP储存液(10mmol/LpH6.5)起始反应，0.5-1min后加入200u1的HC1(2mol/L)终止反应。取500P1在闪烁计数杯中烘干以去除CO2,最后加入0.

5、5ml水和4.5ml闪烁液(PPO8.5g，POPOP0.5g,TritonX-1000.51，甲苯1.01)，进行液闪计数。活力计算方法如下：駿化酶活力(Mmol/min/mg蛋白)=14C(dpm)/(dpm14C/umolCO2)/时间(min)/蛋白量(mg)2.2.3初始活性和总活性的测定Rubisco在体内的含量很高，但它的活性很低，许多实验表明这是由于体内的酶只有一部分是活化的。可用下而的图来表示Rubisco活化过程:、钝化活作ERi——>E<——>(ECM)i——>(ECM)R<——>(ECM)RC^=^(ECM)+PRC&MRCR=RuBPC=C

6、O2M=Mg2+P=产物Rubisco在体内的活化状态与植物的生理状态有很大的关系，它的活化状态可用活化率来表示。Rubisco的活化率为其初始活性除以总活性再乘以100。(1)初始活性的测定将20ul植物材料初提液直接加到480u1的反应液(内含0.4mmol/LRuBP)中。在25°C保温0.5-1min后，力口200u1HC1(2mol/L)终止反应。以下步骤及活性计算与上所述和同。(2)总活性的测定将20ul植物材料粗提液加入460ul反应液中，在25°C保温10〜20min充分激活后，加入20MlRuBP后起始反应。0.5-1min后用HCI终止反应。以下

7、步骤与初始活性的测定相同。(3)Rubisco活化率计算Rubisco活化率=初始活性/总活性X1003.2偶联酶测定法3.2.1酶的活性测定在2.7ml反应液(Tris-HClpH8.2100mmol/L，NaHCO310mmol/L，MgCb20mmol/L，DTT1mmol/LNADH0.5mmol/L，ATP5mmol/L，)中加入100Pl活化过或未活化过的蛋白(2mg/ml)。然后加入100il三磷酸廿油激酶/三磷酸廿油醛脱氢酶(1:1)，在340mn测光吸收为仏，最后加入100liRuBP,立刻每隔15s至30s间隔测定光吸收变化为E!。3.2.2