实验六吲哚乙酸氧化酶活的测定

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1、实验六、吲哚乙酸氧化酶活性的测定南京师范大学生命科学学院一，实验目的与要求了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分布；掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性的方法。二，实验材料与试剂1，材料绿豆幼苗的下胚轴。2，试剂20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)，(使用前混合，避光保存）。三、实验原理1、知识背景知识背景：植物的生长物质定义：调节植物生长发育的物质。分类：1、植

2、物激素（planthormone）在植物体内合成、并从产生处运送到别处，对发育产生显著作用的微量有机物；2、一些具有植物激素活性的人工合成物质。五大类激素的生理功能种类主要生理作用生长素促进生长、促进生根、发芽赤霉素促进细胞伸长、促进种子萌发、果实成熟细胞分裂素促进细胞分裂脱落酸抑制细胞分裂、促进叶、果实衰老脱落乙烯促进果实的成熟五大类激素的产生部位种类主要合成部位生长素主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子赤霉素未成熟的种子、幼根、幼芽细胞分裂素主要是根尖脱落酸根冠、萎蔫的叶片等乙烯植物体各个部位。生长素是什么1934年提取：吲哚乙酸（I

3、AA）苯乙酸（PAA）吲哚丁酸（IBA）具有生长素效应的还有：生长素的发现燕麦胚芽鞘Darwin的向光性实验燕麦胚芽鞘去除顶端Darwin的向光性实验燕麦胚芽鞘加不透明帽子燕麦胚芽鞘加透明帽子达尔文的推测：单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某种刺激，当这种刺激传递到下部的伸长区时，会造成背光面比向光面生长快，因而出现向光性弯曲。詹森的实验（1910）和拜尔的实验（1914）詹森实验证明：胚芽鞘尖端产生的刺激物可以透过琼脂片。拜尔实验证明：弯曲生长是因为顶尖产生的刺激物分布不均匀造成的。燕麦胚芽鞘去除顶端，加琼脂块燕麦胚芽鞘去除顶端，加处理

4、过的琼脂块F.W.Went的实验实验结论总结生长素的产生部位：生长素的作用部位（胚芽鞘的生长部位）胚芽鞘的感光部位：胚芽鞘的尖端胚芽鞘的尖端下段胚芽鞘的尖端结论：胚芽鞘顶端能产生化学物质，向下传输到去顶胚芽鞘，并影响后者的生长；Went称这种化学物质为生长素；1934年首次提取纯化出刺激生长的物质，经鉴定为吲哚乙酸（IAA）。单侧光使背光一侧比向光一侧生长素分布得多；背光一侧的细胞纵向生长的快，结果使得茎朝向生长慢的一侧弯曲。生长素为什么能引起向光弯曲？生长素的产生部位生长素的分布生长素的运输方向主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子。大多

5、集中在生长旺盛的部位。从植物体形态学上端向形态学下端运输。根：背向根尖运输茎：背向茎尖运输生长素的分布与运输010-1010-810-610-410-2c/mol·L-1促进生长抑制生长根芽茎对生长素的敏感度：A生长素的生理作用和最适浓度低促高抑生长素浓度的调节方式：生长素的结合：束缚生长素自由生长素无活性有活性与糖、氨基酸等结合合成、降解、运输、结合、区域化生长素的降解：1）光氧化；2）酶促降解脱羧降解（吲哚乙酸氧化酶IAAoxidase）不脱羧降解2、综上所述吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。生长素分

6、布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即：IAA氧化酶活力=IAA减少的速率3、实验设计在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最大光吸收峰。比色法（分光光度法）注意：如果待测物与另一底物反应后1，生成稳定的产物；2，产物有特定的光吸收峰。三，实验步骤1，提取IAA氧化酶称取0.5g绿豆下胚轴，分次加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）5mL，冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液。试管号MnCl22、4-二氯酚IAA

7、(200ug/mL)酶液磷酸缓冲液(pH6.0)实验1mL1mL2mL1mL5mL对照1mL1mL2mL——6mL两管分别混匀，25℃水浴保温30min。2，IAA氧化酶与IAA的反应3，测定IAA氧化酶活性混合试剂B：0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50)30min后另取2支试管，每支加入试剂B4mL，再按表加入反应液orIAA的梯度浓度溶液各2mL。试管实验’对照’反应液（各）实验溶液2mL对照溶液2mL2支试管于40℃下保温30min，使反应液呈红色。530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。4.

8、制作标准曲线试管0123456IAA梯度液0ug/ml2ug/mL5ug/mL10ug/mL15ug/mL20ug/mL25ug/mL另取7支试管，每支加入试剂B2mL，再按表加入IAA的梯度浓度溶液各1mL。以0管溶液调零，分别测定