实验26吲哚乙酸含量与吲哚乙酸氧化酶活性的测定

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1、实验26吲哚乙酸含量与吲哚乙酸氧化酶活性的测定 植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸（1AA）是植物体内普遍存在的一种生长素。于不同的生育期测定不同器官中IAA的含量以及IAA氧化酶的活性，对于研究植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。Ⅰ吲哚乙酸含量的测定一、原理1947年，我国植物生理学家汤玉玮等发现，在无机酸存在下，吲哚乙酸能与FeCl3作用，生成红色的鳌合物。该物质在530nm有最大吸收峰，由此引出IAA的比色定量测定，此法可测出μg量级的IAA。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）

2、实验材料玉米种子。（二）试剂1.IAA标准溶液：精确称取IAA（A.R.）10mg，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至100mL（其浓度为100μg/mL）作为贮备液；然后用贮备液配成0（空白）、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/mL的系列浓度标准溶液，作为工作液（现用现配）。2.试剂A：内含0.5mol/LFeCl3溶液15mL、浓H2SO4（比重1.84）300mL、蒸馏水500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，lmL试液需加此试剂4mL。3.试剂B：内含0

3、.5mol/LFeCl3溶液10mL、35％高氯酸500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，lmL试液应加此试剂2mL。试剂A与试剂B可任选一种（试剂B比试剂A灵敏）。4.0.1mol/LNaOH溶液。5.甲醇。（三）仪器设备分光光度计，离心机，粉碎机，天平，水浴锅，移液管，大试管，烧杯。三、实验步骤1.标准曲线绘制取干洁大试管8支（0～7号），依次加入IAA系列浓度工作液2mL，分别加入试剂B4mL（或试剂A8mL），于40℃温箱中暗保温30min（加速显色反应）；于530nm下比色，以OD值为

4、纵坐标，以IAA浓度（μg/mL）为横坐标，绘出一条标准曲线。2.生长素的提取与测定将风干的玉米种子（最好是白玉米）用粉碎机磨成细粉（约lmm大小的细粒，太粗提取不完全，太细加热时易糊化而使离心困难）；称取粉末10g装入烧杯，加入0.1mol/LNaOH溶液40mL，于100℃水浴中煮沸15min（上面加盖防止水分蒸干）；取出烧杯后再向其内加入0.1mol/LNaOH溶液25mL，充分摇匀，用甲醇定容至100mL，静置30min，取上层液离心30min，上清液即为IAA提取液。取干洁大试管2支，

5、依次各加入上述样品IAA提取液2mL和试剂B4mL（或试剂A8mL），于40℃温箱中显色30min，在530nm下比色（以标准曲线的“0”调零），记录OD值。四、结果计算式中：A——标准曲线上查得的IAA量，μg。Vl——样品提取液体积，mL。W——样品重量，g。V2——样品反应液体积，mL。 Ⅱ吲哚乙酸氧化酶活性的测定一、原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下，被分解成不活跃的物质。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平起着重要的作用。酶活力的大小可用其破坏吲哚乙酸的速度表示，

6、吲哚乙酸的含量可用比色法测定。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料大豆或绿豆幼苗的下胚轴。（二）试剂1．0.02mol/L磷酸缓冲液（pH6.1）。2．1mmol/LMnCl2：称取MnCl2·4H2O19.8mg用蒸馏水定容至100mL。3．1mmol/L2,4–二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸馏水定容至100mL。4．200μg/mLIAA。5．试剂A：内含0.5mol/LFeCl3溶液15mL、浓H2SO4（比重1.84）300mL、蒸馏水500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，l

7、mL试液需加此试剂4mL。6．试剂B：内含0.5mol/LFeCl3溶液10mL、35％高氯酸500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，lmL试液应加此试剂2mL。试剂A与试剂B可任选一种（试剂B比试剂A灵敏）。（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，移液管（5mL2支，2mL2支，1mL4支），烧杯1个，恒温水浴，天平，试管12支。三、实验步骤1.吲哚乙酸氧化酶的制备（1）将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3～4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作实验材料。（2）取20株下胚轴，称得重量

8、，置于研钵中加入冰冷的磷酸缓冲液（pH6.1）5mL及石英砂少许，于冰浴中研磨成匀浆，再按100mg鲜重加1mL缓冲液的比例稀释之，离心（4000rpm）20min，所得上清液即为酶液。2.标准曲线的制作（1）配制吲哚乙酸的系列标准溶液，其浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5、10、15、20、25μg/mL。（2）取干洁的大试管9支，每支加入试剂B4mL，再分别加入不同浓度的IAA溶液各2mL，摇匀，于40℃的温箱中保温30min，使反应呈红色。（3）取反应液用分光光度计进行测定，测定时用