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1、ReportSmartly－萤光素酶报告基因技术自然界的萤光发光海星发光甲壳虫发光真菌发光节虫自然界的萤光发光鱼发光甲虫自然界的萤光萤火虫报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或”效果”荧光-Fluorescence萤光-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）是化学发光（Chemilumi-nescence）的一种，激发能量来
2、自化学反应吸收来自光源的光，再发射另一光子萤光发光计（Luminometer）荧光计（Fluorometer）液闪仪（ScintilationCounter）电荷耦合装置光学成像系统（CCDopiticalimagingsystem）荧光显微镜各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶优越的灵敏度高信号值无内源活性需要底物ß-gal灵敏度好细菌，血清等内源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）灵敏度好植物中内源活性低90%的E.coli,人／动物细胞中有内源活性酶的扩散可引起“过度报告”需要底物
3、SEAP（分泌性碱性磷酸酶）分泌性报告基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它细胞类型中有高的内源活性需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性的灵敏度底50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋白）显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点非放射性检测快（比CAT等）灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰
4、期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）线形范围广（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力萤光素酶报告基因的使用原理:制备含有luc/Rluc的DNA转染提供刺激测量萤光调节序列Luc２在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义RN
5、A受体蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制启动子/增强子分析“碰撞启动子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+FireflyandRenilla萤火虫生物萤光的化学萤光素+ATP+O2萤光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+Light萤光素酶:单体,61,000Daltons辅-底物:ATP.Mg2+萤光素:Mg2+海肾萤光素酶反应Coelenterazine+O2萤光素酶Coelente
6、ramide+CO2+Light萤光素酶:单体,36,000Daltons萤光素:(Coelenterazine)EnzymestructuresFireflyRenilla为什么要使用双报告基因报告基因A(首要信号)报告基因B(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定特异生物学反馈细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal或GUS活性.CAT,-Gal和GUS检测是终点检测.不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏
7、而快速．传统的双报告基因的缺点双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照的优点速度样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测，样品不必分份实验质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=对照的（海肾萤光素酶)实验的(萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）数据处理举例第一天 萤光素酶活性(RLU)比率归一的活性样品处理重复ＦＲ（F:R)变化倍数对
8、照１5,1282,511２7,5533,815３10,5555,4137,7453,9131.981.00处理Ａ１5,13764,467２40,7123,57488,7877,6546,02925,23211.525.82处理B1587,6355,144988,3478,8323409,8813,564661,9545,847113.2157.18第二天对照１15,52920,4330.76２21,89730,8410.7110,76013,6200.7
