抗生殖支原体MgPa’重组蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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1、·主要缩略语英文索引AA/aaAminoacid氨基酸AmpAmpicillin氨苄青霉素8-AG8-azaguanine8-氮鸟嘌呤BpBasepair碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白IIFIndirectimmunofluorescentassay间接免疫荧光法DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EBEthidiumbromide溴化乙啶E.coliEscherichiacoli大肠埃希菌EDTAEthylenediam

2、ietetraaceticacid乙二胺四乙酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FCSFetalcowserum胎牛血清GSHReducedglutathione还原型谷胱苷肽GSSGOxidizedGlutathione氧化型谷胱甘肽HATHypoxanthineaminopterinthymidine次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷HEPESN-2-Hydroxyethylopiperazine-N’-2-ethanesulfonicacidN-2-羟甲基哌嗪

3、-N’-2-乙基磺酸HGPRTHypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HisHistidine组氨酸6×His6-histidinepeptide6个组氨酸残基HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HTHypoxanthineandthymidine次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷IgImmunoglobulin免疫球蛋白IPTGIsopropβ-D-thiogalactopyranoside异丙基硫代-β-D-半乳糖

4、苷1····kDaKilodalton千道尔顿LBLria-bertainmediumLB培养基mAbMonoclonalantibody单克隆抗体MrMolecularweight分子量NCNitrocellulose硝酸纤维素膜ODOpticaldensity光密度PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosophatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PEGPolyaethyl

5、eneglycol聚乙二醇SDSSodiumDodecylSulphate十二烷基硫酸钠RPMRevolutionpermin每分钟转速TBSTris-bufferedSalineTris缓冲盐溶液TEMEDN,N,N´N´-tetramethylethylenediamineN,N,N´N´-四甲基乙胺TMBTetramethylbenzidine四甲基联苯胺TpTreponemapallidum梅毒螺旋体TrisTris-（Hydroxymethyl）aminomethane三羟甲基氨基甲烷2····抗生殖

6、支原体MgPa’重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定硕士研究生：胡旭导师：吴移谋教授中文摘要目的：将本试验室构建的含生殖支原体黏附素（Mycoplasmagenitaliumadhesinprotein,MgPa）蛋白优势表位基因（MgPa’3223～4092bp）的重组表达载体pET-30a（+）/MgPa’在表达宿主菌E.coliRosettaTM2（DE3）中进行诱导表达，纯化表达产物并进行抗原性分析。应用杂交瘤技术，将SP2/0细胞与经重组蛋白MgPa’免疫的小鼠脾细胞进行融合，筛选抗重组蛋白MgPa’的单克

7、隆抗体（mAb），并进行鉴定和纯化。由此初步确定该mAb的应用价值，并为研制Mg感染诊断试剂盒奠定基础。方法：（1）采用镍亲和层析法纯化重组蛋白MgPa’，并用SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定表达产物。（2）以纯化复性后的MgPa’重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。（3）体内诱生腹水法制备抗体，ELISA法检测抗体效价，采用竞争法ELISA和Western-blot分析mAb的特异性，用mA

8、b亚类测定试剂盒鉴定mAb的类别，用硫酸铵沉淀法对腹水中的mAb进行纯化。结果：重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下，表达了相对分子量（Mr）约为37kDa的目的蛋白，目的蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在；经Ni-NTA亲和层析法纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白；应用纯化复性后的重组蛋白MgPa’免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术进行细胞融合；应用ELISA法筛选出了