超声微泡介导转染Akt1基因对大鼠心肌细胞缺血2f再灌注损伤保护作用的分析

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1、徐州医学院硕士学位论文缩略词表Abbreviation缩略词英文全称中文全称BrduBromodeoxyuridine5-溴脱氧尿核苷cTnICardiactroponinI心肌肌钙蛋白IDMEMDulbecco'sModifiedEagleMedium改良细胞培养基EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetertraaceticacid乙二胺四乙酸EGFPEnhancedgreenfluorescentprotein增强型绿色荧光蛋白GFPGreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白I/RIs

2、chemia/reperfusion缺血/再灌注LB.Lysogenybroth细菌培养基MBMicrobubblecontrastagent微泡MIMechanicalindex机械指数ODOpticaldensity光密度PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PKB/AktProteinkinaseB蛋白激酶BPDK1phosphoinositide-dependentkinase-1磷酸肌醇依赖性激酶-1USUltrasound超声1徐州医学院硕士学位论文论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得

3、的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：日期：200年月论文使用授权声明本人完全了解徐州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：导师签名：日期：200年月徐州医学院硕士学位论文论文审阅认定书研究生在规定的学习年限内，按照研究生培养方案的

4、要求，完成了研究生课程的学习，成绩合格；在我的指导下完成本学位论文，经审阅，论文中的观点、数据、表述和结构为我所认同，论文撰写格式符合学校的相关规定，同意将本论文作为学位申请论文送专家评审。导师签名：日期：200年月徐州医学院硕士学位论文超声微泡介导转染Akt1基因对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤保护作用的研究中文摘要目的探讨超声微泡介导Akt1基因转染的可行性和安全性，观察超声微泡破裂法转染PKB(ProteinkinaseB)/Akt1基因对体外培养新生大鼠心肌细胞摸拟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的保护作用

5、。方法1.采用胰蛋白酶、EDTA、Ι型胶原酶联合分次消化法分离新生SD（Sprague-Dawley）大鼠心肌细胞进行体外培养，联合应用细胞差速贴壁法和采用Brdu抑制法提高心肌细胞纯度。用于转染的pEGFPC1-Akt1基因，含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为报告基因，荧光倒置相差显微镜下计数细胞转染率。2.（1）超声微泡介导Akt1基因分别转染293FT细胞和新生大鼠心肌细胞实验分组：293FT细胞和新生大鼠心肌细胞各分五组：A组单纯质粒组；B组微泡+质粒组；C组超声+质粒组；D组超声+微泡+质粒组；E组超声+微泡+质粒（超声探头从培养

6、皿上方浸入培养液进行超声辐照），每组细胞用于转染率和坏死率检测各设五个复孔。使超声探头距离培养皿底1cm，超声探头与培养皿底部之间填充超声耦合剂，超声发射频率1.7MHz，机械指数（mechanicalindexMI）1.5，超声辐照时间2min。使细胞培养液终体积为1.25ml,微泡体积浓度为20%，培养液中质粒终浓度为20ug/ml。超声辐照6h后，每组各取5孔用于检测转染损伤细胞的坏死率，每组另外五孔更换为含20%胎牛血清的DMEM，继续培养42h用作检测细胞转染率。（2）新生大鼠心肌细胞基因转染的参数优化：①.据不同机械指数实验分三2徐州医

7、学院硕士学位论文组，每组细胞用于转染率和坏死率检测各设五个复孔：A组MI0.5；B组MI2.；C组MI1.5。超声发射频率均为1.7MHz，超声辐照时间均为2min，超声辐照6h后，每组各取5孔用于检测转染损伤细胞的坏死率，每组另外五孔更换为含20%胎牛血清的DMEM，继续培养42h用作检测细胞转染率。②.选用优化的超声机械指数，据不同超声辐照时间实验分四组，每组细胞用于转染率和坏死率检测各设五个复孔：A组超声辐照时间1min；B组超声辐照时间2min；C组超声辐照时间3min；D组超声辐照时间4min。超声发射频率均为1.7MHz，机械指数均为1

8、.5，使细胞培养液终体积为1.25ml,微泡体积浓度为20%，培养液中质粒终浓度为20ug/ml。超声辐照6h后，每组各取