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《安胃汤对大鼠慢性萎缩性胃炎EGF和EGFR表达的PCR的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
·目录中文摘要················································1英文摘要················································3引言·················································7正文·················································91.实验材料和方法··········································91.1实验材料···············································91.2实验方法·············································〃〃〃〃·111.3统计学方法········································162.实验结果··················································162.1动物外观观察···········································162.2胃粘膜大体形态观察·····································162.3胃粘膜光学显微镜观察···································162.4血清中表皮生长因子及其受体含量检测结果············172.5实时荧光定量PCR结果···········································192.6电泳图片·····················································193讨论·················································204.存在的问题和展望·······································32结论···············································34参考文献···············································35附录···············································39综述···············································40致谢···············································48攻读学位期间发表的学术论文目录···················49作者声明·············································50个人简历···············································51··· ·中文摘要目的:观察安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠血中表皮生长因子及其受体表达量的影响，从而探讨安胃汤治疗慢性萎缩性胃炎疗效的分子机制，从基因水平上阐释名老中医治疗慢性萎缩性胃炎的学术理论。方法:健康清洁级雄性Wistar大鼠84只，体重140~170克，完全随机分为空白对照组（A组）、病理模型组（B组）、安胃汤大剂量组（C组）、安胃汤中剂量组（D组）、安胃汤小剂量组（E组）、维酶素对照组（F组）、胃复春对照组（G组）共七组，每组12只。空白组给予正常饮食进水，其余六组采用甲基硝基亚硝基胍（MNNG）溶液建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型。于造模成功后开始，安胃汤大剂量组、安胃汤中剂量组、安胃汤小剂量组、维酶素对照组、胃复春对照组分别给予药物灌胃治疗4周；空白组，病理模型组同时给予每天每只2ml生理盐水灌胃。各组大鼠禁食12ｈ，将大鼠麻醉，股动静脉取血，ACD抗凝，淋巴细胞分离液分离有核血细胞，提取有核细胞总RNA，经反转录成cDNA，设计合成EGF和EGFR特异性引物，通过real-timePCR的方法检测7组大鼠血中EGF和EGFR基因表达的差异；同时剖腹取胃，沿胃大弯剪开，并向胃窦近幽门口至胃大弯方向取1.0㎝×1.0㎝×0.5㎝胃粘膜组织，臵于10%甲醛固定，作常规石腊包埋切片，做胃黏膜组织病理观察。结论:1.胃黏膜大体形态观察：通过观察皱襞多少、走向，黏膜色泽，是否有出血等情况，发现病理模型组皱襞减少或消失，走向紊乱，表面粘液少，黏膜色泽淡白或灰白，且部分伴有散在出血点。经安胃汤大、中、小剂量组，维酶素对照组、胃复春对照组治疗后，胃黏膜损害均有不同程度的改善，以安胃汤大剂量组效果最为明显。2.胃黏膜光学显微镜观察：通过观察胃黏膜上皮细胞排列状况、固有腺体数量，有无炎性细胞浸润等情况，发现病理模型组固有腺体数量明显减少，排列紊乱，有炎性细胞浸润。经安胃汤大、中、小剂量组，维酶素对照组，胃复春1··· ·对照组治疗后，胃黏膜萎缩有不同程度的逆转，以安胃汤大剂量组效果最为明显。3.病理模型组血清中EGF含量明显高于空白组，两者比较有显著差异（P<0.01）。安胃汤大、中、小剂量组、维酶素对照组、胃复春对照组与病理模型组相比均能明显降低血清中EGF含量，与之比较均有显著差异（P<0.05），说明安胃汤、维酶素对照组、胃复春对照组均能有效调控血清中EGF含量；安胃汤大剂量组EGF值与空白对照组EGF值最为接近，两组比较差异无显著意义（P>0.05）,且安胃汤大剂量组与维酶素对照组、胃复春对照组比较差异有显著意义（P<0.05），安胃汤中、小剂量组与维酶素对照组、胃复春对照组EGF含量比较无显著差异（P>0.05）。4.病理模型组血清中EGFR含量明显高于空白对照组，两者比较有显著差异（P<0.01）。安胃汤大、中、小剂量组、维酶素对照组、胃复春对照组与病理模型组相比均能明显降低血清中EGFR含量，与之比较有显著差异（P<0.05），说明安胃汤、维酶素对照组、胃复春对照组均能有效调控血清中EGF含量；安胃汤大剂量组EGFR值与空白对照组EGF值最为接近，两组比较差异无显著意义（P>0.05），且安胃汤大剂量组与维酶素对照组、胃复春对照组比较差异有显著意义（P<0.05），安胃汤中、小剂量组与维酶素对照组、胃复春对照组EGFR含量比较无显著差异（P>0.05）。结论:1.安胃汤可以调控血液中EGF的表达水平，改善胃黏膜状态，促使胃黏膜修复；2.安胃汤能够显著改善胃黏膜组织病理形态；3.安胃汤可以治疗CAG，其机理可能是通过降低EGF及EGFR在血液中的表达，改善微循环，增加胃黏膜血流量，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，从而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。关键词：安胃汤；慢性萎缩性胃炎；表皮生长因子；表皮生长因子受体2··· ·EffectsofAnweiDecoctiononEGFandEGFRExpressionofratswithchronicatrophicgastritisABSTRACTObjective:ObservationabouteffectsofAnweiDecoctiononEGFandEGFRExpressionofratswithchronicatrophicgastritis,soastoinvestigatethemolecularmechanismofAnweiDecoctionincuringchronicatrophicgastritis.Andthen,wecanexplainthetheorythatoldtraditionalChinesemedicalsciencetocurethechronicatrophicgastritisfromtheaspectofgeneticlevel.Methods:Eighty-fourhealthymaleWistarratsandtheseratsareintheweightrangeof140~170g.Theseratswererandomlydividedintosevengroups:blankcontrolgroup(groupA),pathologicmodelgroup(groupB),AnweiDecoctionhighdosegroup(groupC),AnweiDecoctionmoderatedosegroup(groupD),AnweiDecoctionlowdosegroup(groupE),Weimeisucomparegroup(groupF)andWeifuchuncomparegroup（groupG）.Theblankgroupweregivenanormalwaterdiet，othersixgroupsweretreatedwithmethyl-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)solutioninordertoestablishratswithchronicatrophicgastritis.Afterthemodelsweresuccessful,anweidecoctionofhigh-dosegroup，anweidecoctionmoderate-dosegroup,anweidecoctionoflow-dosegroup,WeimeisucomparegroupandWeifuchuncomparegroupweregiventheappropriatedrugfor4weeks.Theblankgroupandpathologicalgroupweregiven2mlbrinewaterperdayatthesametime.Attheendoftheseventeenthweek,allthegroupswerefastingfor12hours.Next,theratswereanesthetizingsoastogainbloodsamplesfromfemoralarteryandvein,andthenusingACDtohaveanticoagulation.And3··· ·then,theLymphocytesseparationMediumwillisolatenucleatedcellsfortakingnucleatedcellstotalRNA,whichwillbereversedandcopiedintocDNA.ThecDNAwasdevisedtosynthetizetheAueleSpecificPrimersofEGFandEGFR.Bymeansofapplyingreal-timePCR,theAueleSpecificPrimersofEGFandEGFRwasusedtotestthedifferentgeneexpressionofEGFandEGFRinratsoffivegroups.Atthesametime,takingthestomachwithlaparotomy,cutalongthegreatercurvatureofthestomachtotakegastricmucosaof1.0cm×1.0cm×0.5cmthedirectionofthestomachantrumnearthegreatercurvatureofthestomach,thenputtingin10%Specimensforthepurposeofmakingregularparaffin-cutsection.Then,applyingtheregularparaffin-cutsectionintestingthedifferentgeneexpressionofEGFandEGFRinthebloodandthegastricmucosatissuesofratssoastoobservethegastricmucosaandthepathologyofgastricmucosatissues.Results:1.Observationaboutgeneralsituationofgastricmucosa:Throughthewayofobservingtheamountanddirectionofplica,thecolorofmucousmembrane,andthesituationthatwhethertohavehaemorrhageornot.Onthebasisofthesesituations,wecanfindthesituationsthat:theplicainmodelgroupwillreduceordisappear；theplicatendstodisorder；thesurfacemucouscutsdown;thecolorofmucousmembranebecomespalewhiteandgreyishwhitewithbloodsport.AftertreatingwithWeimeisu,Weifuchun,andthelowdose,moderatedose,highdoseofAnweiDecoction,allthegastricmucosalinjurywillbeamelioratedinvaryingdegrees,especiallytheeffectofusinghighdoseofAnweiDecoction.2.Observationlightmicroscopeaboutgastricmucosa:Throughthewayofobservingthearrangementsituationofepithelialcellingastricmucosa,theamoutofinherentglandbody,thecaseofinflammatorycellinfiltrationandsoon.Fromtheobservationofthesesituations,wegottheresultthattheinherentglandbodyinmodelgroup4··· ·reducedvisiblyinquantity,arrangedinconfusion,andinfiltratedbyinflammatorycell.AftertreatingwithWeimeisu,Weifuchun,andthelowdose,moderatedose,highdoseofAnweiDecoction,allthegastricmucosalinjurywillbereversedinvaryingdegrees,especiallytheeffectofusinghighdoseofAnweiDecoction.3.TheEGFcontentoftheSeruminmodelgroupwasapparentlyhigherthantheblankcontrolgroup.Comparingthesetwogroups,therehasaobviousdifference（P<0.01）.ComparingthegroupsofAnweiDecoctionwithlowdose,moderatedose,andhighdose,Weimeisugroup,Weifuchungroupwithmodelgroup,theformerhasobviousfunctiontolowertheEGFcontentofSerum.Andtherealsoexistobviousdifference（P<0.05）betweenthesetwoparts.Fromthisresult,wefoundthatAnweiDecoction,Weimeisu,WeifuchuncanregulateandcontroltheEGFcontentofSerumeffectively.What’smore,theEGFofAnweiDecoctionhighdosegroupisverysimilartotheEGFofblankcontrolgroup,andhasnosignificanceintheircontrast（P>0.05）.However,therehassignificance（P<0.05）whentheAnweiDecoctionhighdosegroupcomparedwiththegroupofWeimeisuandWeifuchun.Ithasnosignificance（P>0.05）whenmakingcomparationbetweenthegroupsoflowdose,moderatedose,Weimeisu,Weifuchun.AllthatmeansthetreatingeffectofAnweiDecoctionhighdosegroupisthebestoneforpatient.TheEGFRcontentoftheSeruminmodelgroupwasapparentlyhigherthantheblankcontrolgroup.Theyhaveaobviousdifference（P<0.01）.ThegroupsofAnweiDecoctionwithlowdose,moderatedose,andhighdose,Weimeisugroup,Weifuchungroupwithmodelgroup,theformerhasobviousfunctiontolowertheEGFRcontentofSerum.Andtherealsoexistobviousdifference（P<0.05）betweenthesetwoparts.Fromthisresult,wefoundthatAnweiDecoction,Weimeisu,WeifuchuncanregulateandcontroltheEGFcontentofSerumeffectively.AndtheEGFRof5··· ·AnweiDecoctionhighdosegroupisverysimilartotheEGFofblankcontrolgroup,andhasnosignificanceintheircontrast（P>0.05）.ThecomparationbetweenAnweiDecoctionhighdosegroup,WeimeisugroupandWeifuchungrouphasobvioussignificance（P<0.05）.But,ithasnoobvioussignificancewhenthecomparationbetweenthegroupsoflowdose,moderatedose,Weimeisu,Weifuchun（P>0.05）.therefore,thetreatingeffectofAnweiDecoctionhighdosegroupisthebestoneforpatient.Conclusions:1.AnweiDecoctioncancontroltheexpressionlevelofEGFinbloodandgastricmucosatissuessoastochangethestateofgastricmucosaandpromotetherevisionofgastricmucosa.2.AnweiDecoctionisabletosignificantlyimprovethepathomorphologicalfeaturesofgastricmucosatissues.3.AnweiDecoctioncancuretheCAG.ThecuringmechanismisinaccordancewiththereductionoftheexpressionofECGandECGRinbloodandgastricmucosasoastoimprovethemicrocirculation,addtheCBFofgastricmucosa,strengthenthedefenseofmucosabarrierandthefunctionofreparing.Alloftheseeffectscanhelpustoachievethegoalthatcuresthechronicatrophicgastritis.Keywords：AnweiDecoction;chronicAtrophicGastritis；ECG、ECGR6··· ·引言慢性萎缩性胃炎(CAG)是以胃黏膜萎缩变薄、腺体减少或消失为特征的疾病，常伴有肠上皮化生(IM)和不典型增生(ATP)，具有病程长、反复发作等特点。中医学将其归属于“胃脘痛”、“痞满”等范畴。其临床多表现为胃脘隐痛或上腹部胀闷不适，嗳气或呕恶，食欲不振等。1978[1]年世界卫生组织将CAG列为胃癌前状态之一，引起国内外医学界的广泛关注和高度重视。现代医学认为CAG的发病机制是，当其伴有胃粘膜不典型增生和肠上皮化生时，则属于胃癌前病变，经过一个漫长的，多阶段、多基因的变异积累过程可发展成胃癌[1]。CAG的癌变率为10%～19%，在胃粘膜癌前病变中占有重要地位。我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二，病死率居各类恶性肿瘤之首，在老年人群中胃癌的病死率有增加的趋势[2]。慢性萎缩性胃炎(CAG)是慢性炎症过程中出现胃粘膜萎缩，主要表现为胃粘膜固有腺体（幽门腺或泌酸腺）数量减少，并伴有纤维组织增生、粘膜肌增厚，胃粘膜变薄。长期不良的化学性的、物理性的有害因子和精神刺激反复作用于人体，出现攻击因子和保护因子的平衡失调，胃粘膜屏障抵御能力下降，使H+返流，胃酸中胃蛋白酶对粘膜的损害加重；粘膜本身由于基因调控失衡，粘膜下血液循环障碍，胃肠激素、细胞因子分泌和免疫功能紊乱及外界不良因子的刺激下，导致细胞的增殖与凋亡关系不平衡，增加了自发性DNA复制错误的可能，导致细胞变异，而形成了CAG粘膜萎缩、肠化、异型增生及炎性介质的释放，炎性细胞浸润的基本病理[3]。研究表明EGF对SD大鼠CAG模型胃粘膜的萎缩有逆转作用，在癌前病变中EGF和EGFR有较高的阳性率，随着异型增长程度的加重，阳性率呈上升趋势，表明EGF和EGFR参与了胃黏膜的癌变过程。在治疗上尚缺乏特效的疗法，主要是避免诱发因素、对症治疗、保护胃黏膜、清除幽门螺杆菌、增强胃排空能力等。中医药在治疗本病7··· ·时，具有辨证论治、灵活加减、毒副作用小等特点，而显示出独特优势，与单纯西药相比更体现了它的优越性及组方的合理性[3]。安胃汤是根据已故全国名老中医林沛湘教授治疗慢性胃病经验组方而成，在临床应用多年，疗效显著。项目组的前期实验研究表明，安胃汤对大鼠慢性萎缩性胃炎血清胃泌素、胃动素及胃粘膜生长抑素的调节，达到改善胃粘膜的炎症反应，促进腺体的再生，增加微循环血流，促进局部胃粘膜的修复。临床研究也证实了安胃汤对慢性萎缩性胃炎患者的血清胃泌素、胃动素及胃粘膜生长抑素的调节作用，并在胃镜及病理组织学上证实了安胃汤对胃粘膜的修复作用。本课题通过对胃黏膜表皮生长因子的研究观察，意从基因水平上阐述安胃汤治疗慢性胃炎的作用机理。通过RT-PCR方法观察安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠血液中表皮生长因子及受体表达量的影响，从基因水平上阐释名老中医治疗慢性胃炎学术理论。8··· ·正文1实验材料和方法1.1实验材料2.1药物与试剂2.5药物(1)安胃汤药物组成：黄连5g、干姜5g、制半夏10g、百合15g、白芍15g、乌药5g、丹参15g、薏苡仁15g、木香7g、甘草3g等。以上药物由江苏江阴天江药业有限公司生产为中药免煎剂颗粒，由广西中医学院瑞康医院提供。安胃汤按标准动物的等效剂量折算系数法[4]计算，大鼠的等效剂量为等效剂量人日用量95g×0.018×5=8.55g，大鼠灌喂安胃汤大、中、小剂量为8.55g的4:2:1倍，即34.2g、17.1g、8.55g安胃汤分别溶于2mL蒸馏水为大、中、小剂量大鼠每天的用量。(2)胃复春片：杭州胡余庆堂药业有限公司，生产批号：080710，产品规格0.359g/片。购自广西中医学院瑞康医院。制备方法:胃复春片按人等效剂量的2倍量，即0.359g×12×0.018×5溶解于2m1，19.38g胃复春片溶于100m1蒸馏水，冰箱4℃保存。(3)维酶素片：北海阳光药业有限公司，生产批号：070318，产品规格0.2g/片。购自广西中医学院瑞康医院。制备方法:维酶素片按人等效剂量的2倍量，即0.2gx12x0.018x5溶解于2m1，10.8g维酶素片溶于100m1蒸馏水，冰箱4℃保存。2.6试剂(1)造模试剂:N-甲基-N-硝基-N’亚硝基胍(MNNG):TOKYOCHEMICALINDUSTRYCO.LTD。(日本东京化学工业株式会社)。产品批号:M0537。购自上海国药化学试剂有限公司。实验时用水稀释为所需浓度，锡纸包裹容器避光冰箱4℃保存。(2)荧光定量PCR试剂：TRIzol试剂购自Invitrogen公司；FirstStrand9··· ·引物引物序列大小EGF上游：GGCGTGTGCATGTATGTTGAATC212bp下游：CCAACGTAAGTCTCGGTGCTGAEGFR上游：TCAGGGACTGCGAGAACCAAG223bp下游：TCAAAGGTGCCTAGTTGGGTGACβ-actin上游：GAGACCTTCAACACCCCAGCC263bp下游：AATGTCACGCACGATTTCCCcDNAsynthesisKit购自Fermentas公司;SYBRgreen购自美国ABI公司;TaqDNA聚合酶、DL2000Marker购自北京庄盟生物科技有限公司；oligodT序列、引物序列由Invitrogen上海英潍捷基公司合成。(3)其他主要材料及试剂配方：千分之一的DEPC水：购自Biosharp公司，4℃保存。Tris：Tris碱60.57g以800ml蒸馏水溶解，浓盐酸35ml调节器PH至7.2-7.6，蒸馏水定容至1000ml，常温保存。TBS：氯化钠18g，适量蒸馏水溶解，加200mlTris盐酸，调PH至7.2-7.6蒸馏水定容至2000ml，常温保存。1MTris-HC1，PH6.8，在40ml蒸馏水中溶解13.1g的Tris碱，用浓盐酸调至PH6.保存。1.5MTris-HC1，PH8.8在40ml蒸馏水中溶解19.15g的Tri补加水至100ml，4℃保存。5×TBE：Tris54g，硼酸27.5g，0.05mol/LEDTA20ml，双双蒸水补足至1000ml。上样缓冲液：1.1%溴酚蓝，30%蔗糖，双蒸水补足至10ml。医用无水乙醇，购自上海化学试剂有限公司。异丙醇，中国三明市三元化学试剂厂生产。氯仿（三氯甲烷），中国上海化学试剂有限公司生产。琼脂糖，Biowest(西班牙)公司。2.1实验动物健康清洁级雄性Wistar大鼠84只，体质量140-170g，由广西食品药品检验所实验动物中心提供（动物合格证号SCXX桂2003-0001）。2.2主要仪器3K220型低温高速离心机购自Sigma公司。10··· ·7230分光光度计，中国厦门分析仪器厂生产。DU2640型紫外分光光度计，美国Beckman公司生产。DF2C型恒压恒流电泳仪，北京六一仪器厂生产。紫外线透射反射仪（WD－9403C型），北京六一仪器厂生产。凝胶分析系统（GAS7100X型），美国生产。光学显微镜，日本Olympus公司生产。移液枪，Takaratp600多功能彩色图像系统，日本Olympus公司生产。7000型实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司。电热恒温干燥箱（202-OAB型），中国天津市泰斯特仪器有限公司生产。超低温冰箱（MDF-283型），净化工作台SW-CJ-1FD型，中国苏州安泰空气技术有限公司生产。50L液氮罐，中国四川省乐山市东亚机电工贸有限公司生产。冰冻切片机，英国ThermoElecronCorporation生产。TP1020生物组织自动脱水机;EGll40H石蜡包埋机;HM355S型石蜡切片机，德国美康（MICROM）公司生产。YT-6生物组织摊烤片机，湖北省孝感亚光医用电子技术研究电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂生产。BX50F-3双目显微镜(附带自动照相装臵NikonD700)，日本Olypus公司生产。物品处理:所用Eppendorf管及移液枪头均为新开封，用1%DEPC去离子水浸泡过液，以破坏RNA酶，然后用灭菌水洗淋数次，捞出放入预先经300℃烘烤处理的铝制饭盒中，80℃烤干，高压消毒15min，以除去残留的DEPC，经80℃烤干备用。1.1实验方法2.1实验动物分组健康清洁级wistar大鼠84只，雄性，体重140~170克，称量，标记，11··· ·完全随机分为空白对照组（A组）、病理模型组（B组）、安胃汤大剂量组（C组）、安胃汤中剂量组（D组）、安胃汤小剂量组（E组）、维酶素对照组（F组）、胃复春对照组（G组）共七组，每组12只。1.1动物模型制备及给药除A组外，其余各组均采用MNNG法[5]造模，具体造模方法为：每星期先用蒸馏水配制1g/L浓度储存液，避光冷藏保存，再用蒸馏水配制成170μg/L的饮用液，装入200ml的饮水瓶，外涂黑色，每日更换，不限量。6组均自由饮用170mg/L的MNNG液，造模期间不再给予其他饮水，共8w，均普通饲料饲养。8w末，各组随机抽取2只大鼠处死，取胃，行病理检查，判断模型成功与否。造模成功后从第9w开始:A、B组每天每只2mL生理盐水灌胃，C组、D组、E组每天每只取安胃汤混悬液浓度为分别为2.1g/ml（相当于成人等效剂量4倍）、8.55g/ml（相当于成人等效剂量2倍）、4.26g/ml（相当于成人等效剂量1倍），按1ml/100g灌胃，F组、G组每天每只取相应的配成液2mL悬浊液灌胃，1次/日至第12w结束。1.2标本采集各组于给药4w后，禁食24h，给予20％乌拉坦液，按体质量2mL/Kg腹腔注射麻醉大鼠后，股动静脉取血，ACD抗凝，淋巴细胞分离液分离有核血细胞，-80℃冰箱保存，做总RNA提取用；开腹，剖取胃组织，观察胃组织外部形态结构，沿胃小弯切开，以生理盐水将胃粘膜表面污物洗涤干净，展平观察胃黏膜结构形态、色泽。放入10%甲醛溶液中固定，作石蜡切片，行HE染色检测。1.3实验指标检测2.5石蜡制片过程10%甲醛120min-梯度酒精(80%→95%→95%→100%→100%)45min/次→二甲苯lh→二甲苯1h→浸泡石蜡3次，每次45min→常规石蜡包埋→3μm切片。2.6HE染色过程12··· ·(l)切片脱蜡至水:二甲苯10minx2→梯度酒精(100%→100%→95%→95%→90%→80%→70%)2min/次。(2)流动的自来水冲洗。(3)浸入苏木素染液浸染5min。(4)盐酸酒精分化5s-5min→流水冲洗切片。(5)伊红染液染3min→自来水洗。(6)脱水:梯度酒精(95%→95%→100%→100%)2min/次→二甲苯30s。(7)晾干，中性树胶封片，结果观察。HE染色结果判定：细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。1.1实时荧光定量PCR检测胃黏膜EGFmRNA、EFGRmRNA、β-actin的表达2.1组织总RNA（RNAextraction）的抽提⑴实验步骤以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1%DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。尽量快地进行操作，减少RNA降解。1)先加1mlTrizol加入冻存血细胞中，吹打裂解后室温静臵5~10min。2)加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡15s，室温静臵2~3min。3)在4℃下12000rpm离心15min。4)小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静臵10min（RNA沉到底部）。5)4℃12000rpm离心10min，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质（RNA）。6)加入1ml70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇。7)4℃7500rpm离心5min，去除乙醇（尽量用枪头吸干净）后晾5-10min，8)弃上清，倒扣离心管于吸水纸上，空气中晾干约10min，至乙醇13··· ·完全挥发，用20μLDEPC水溶解沉淀的RNA；RNA-80℃保存备用。⑵RNA纯度检测及定量：取RNA1μL，加99μL三蒸水混匀稀释，紫外光光度仪比色测OD值，RNA溶液的A260/280在1.6~1.8之间，表明RNA纯度合格。RNA含量：总RNA浓度（μg/ml）=OD260×40×稀释倍数。⑶RNA质量电泳验证取1μgRNA与5μLDEPC水混合后在1%琼脂糖凝胶中以140V电压电泳20min左右，紫外线下观察RNA电泳条带。1.1逆转录cDNA制备（Reversetranscription，RT）按逆转录试剂盒说明书进行逆转录（RT）：DNA合成利用AMV逆转录试剂盒，以Oligo(dT)15为引物，按试剂盒操作程序，依次加样，反应体系如下:总RNA2μgOligodT（0.5kg/L）2μLdNTP（10mol/L）3μLRnaseinhibitor（40U/μL）1μLMMLV-RT（200U/μL）1μL5×MMLV-RTBuffer6μL加入DEPC处理过的无菌水至30μL混匀，离心，进行逆转录反应。反应条件如下：反应条件：45℃反应1h，95℃5min终止反应。逆转录产物臵于-80℃冰箱保存备用于PCR扩增。1.2荧光定量PCR循环（PolymeraseChainreaction，PCR）2.1阳性标准品及其梯度的制备:(标准曲线定量法)(1)阳性标准品梯度的制备:取阳性标准品1μL按10倍稀释(加水9μL并充分混匀)，依次稀释下去，制备成阳性定量标准品梯度，倍比稀释一14··· ·定要准确，否则影响定量结果。每次上机必须新鲜配制阳性定量标准品梯度，正式上机时以包含所有样本的五个梯度上机即可。(2)RTQ-PCR标准曲线RTQ-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。(3)阴性质控标准品采用灭菌双蒸水1.1待测样本和阳性标准品按以下反应体系进行:PCR反应体系的组成2XSYBRGreenPCRMasterMix10μL上游引物（0.05g/L）1.8μL下游引物（0.05g/L）1.8μLcDNA1.0μLRNaseFreeWater5.4μL反应总体积20.00μL2.1反应条件:预变性，94℃，5min；然后95℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，循环40次；最后，72℃，5min。实验中同步进行内参基因β-actin的定量检测，以目的基因与内参基因相对浓度比作为目的基因的相对表达量。扩增反应在ABI7000荧光定量PCR仪上进行，各样品的荧光信号值由荧光定量PCR仪的支持软件。2.2PCR产物琼脂糖凝胶电泳及成像2.5×TBE配制2%琼脂糖凝胶（含2µl溴化乙锭)，以100-15··· ·2000bpDNALadder作分子量标准，PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，电压80伏，紫外灯下观察电泳结果及成像。1.1统计分析各样品目标基因的相对表达水平通过内参基因进行校准后用（xS）表示，用SPSS13.0forWindows统计软件包对数据进行统计，采用单因素方差分析，进行SNK两两比较。2实验结果2.1动物外观观察空白组大鼠精神状态良好，食量稳定，体重逐渐增加，行动敏捷，眼睛有神，被毛光泽贴身，尾色淡红，大小便正常；病理模型组大鼠精神萎靡，食欲渐减，形体偏小，活动较少，反应迟钝，眼睛无神，被毛杂乱缺乏光泽蓬松，喜扎堆，拱背，尾色淡白或苍白，大便常干溏不调。大鼠给予治疗后上述症状和体征逐渐改善消失，治疗期间体重增长亦较病理模型组为多；以安胃汤大剂量最为明显，维酶素对照组、胃复春对照组、小剂量组大鼠也有所恢复，但不及中、大剂量组明显；小剂量组大鼠的一般表现优于维酶素对照组、胃复春对照组。2.2胃粘膜大体形态观察正常组胃黏膜呈粉红色，表面光滑有光泽，被覆较多粘液，皱襞表面光滑，走向规则，胃壁弹性良好；模型组黏膜薄弱，色泽灰白，表面粘液少，皱襞低平、稀少甚至消失，走向紊乱，胃壁弹力减低，安胃汤高、中、小剂量组、维酶素对照组及胃复春对照组部分胃黏膜基本恢复正常，以大、中剂量组为明显。小剂量组大鼠的胃黏膜状况优于维酶素对照组、胃复春对照组。2.3胃黏膜光学显微镜观察空白对照组胃粘膜厚，各层结构正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，固有腺体形状规则，未见萎缩脱落或缺损，可见少许炎性粒细胞：。（见附录图1）16··· ·病理模型组：胃黏膜全层明显变薄、局灶上皮细胞脱落、糜烂，胃黏膜固有腺体破坏，数量明显减少，排列稀疏紊乱，体积缩小，粘膜固有层淋巴细胞浸润、部分有淋巴滤泡形成。（见附录图2）维霉素对照组：胃黏膜各层结构基本正常，黏膜腺体排列稍有紊乱，体积缩小，偶见有炎细胞浸润。（见附录图3）胃复春对照组：胃黏膜上皮稍变薄，未见明显脱落或糜烂，黏膜固有腺体排列稍有紊乱，部分体积缩小，固有层内可见淋巴细胞浸润。（见附录图4）安胃汤大剂量组：胃黏膜各层结构基本正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，腺体形状规则，未见萎缩脱落及炎细胞浸润。（见附录图5）安胃汤中剂量组：胃黏膜各层结构基本正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，黏膜上皮略变薄，腺体形状规则，未见萎缩脱落及炎细胞浸润。（见附录图6）安胃汤小剂量组：胃黏膜各层结构基本正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，黏膜上皮略变薄，腺体形状规则，可见少许白细胞。（见附录图7）说明胃复春、维霉素与安胃汤各组均能改善胃黏膜的病理形态，但以安胃汤大、中剂量组效果为佳。1.1血清中表皮生长因子及其受体含量检测结果2.1治疗后各组大鼠血清中EGF表达情况对比表1治疗后各组病例血清EGF值比较(xs)组别nEGFβ-actin空白对照组1012.10±1.672)10.05±0.782)模型组1021.95±5.251)20.03±4.351)安胃汤大剂量组1013.29±1.682)12.98±1.832)安胃汤中剂量组1016.11±2.061)2)14.81±1.961)2)安胃汤小剂量组1015.82±2.031)2)13.48±1.351)2)维酶素对照组1015.79±1.651)2)14.08±1.031)2)胃复春对照组1016.39±2.601)2)15.51±1.321)2)17··· ·注：与空白组比较1)P<0.05与模型组比较2)P<0.05模型组型组血清中EGF含量明显高于空白组，两者比较有显著差异（P=0.000<0.01）。安胃汤大、中、小剂量组、维酶素组、胃复春组与模型组相比均能明显降低血清中EGF含量，与之比较有显著差异（P<0.05），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控血清中EGF含量；安胃汤大剂量组EGF值与空白对照组EGF值最为接近，两组比较差异无显著意义（P=0.565>0.05）,且安胃汤大剂量组与维酶素组、胃复春组比较差异有显著意义（P=0.003,P=0.002<0.05），中、小剂量组与维酶素组、胃复春组之间胃黏膜中EGF含量比较无显著差异（P>0.05）。说明，安胃汤大剂量组对患者的疗效最好。1.1治疗后各组大鼠血清中EGFR表达情况对比：表2治疗后各组病例血清EFGR值比较(xs)组别nEGFRβ-actin空白对照组1013.68±2.312)10.05±0.782)模型组1021.30±2.321)20.03±4.351)安胃汤大剂量组1014.24±1.302)12.98±1.832)安胃汤中剂量组1017.09±1.461)2)14.81±1.961)2)安胃汤小剂量组1017.50±3.141)2)13.48±1.351)2)维酶素对照组1017.15±1.761)2)14.08±1.031)2)胃复春对照组1017.40±2.091)2)15.51±1.321)注：与空白组比较1)P<0.05与模型组比较2)P<0.05模型组型组血清中EGFR含量明显高于空白组，两者比较有显著差异（P＝0.000<0.01）。安胃汤大、中、小剂量组、维酶素组、胃复春组与模型组相比均能明显降低血清中EGFR含量，与之比较有显著差异（P<0.05），说明安胃汤、维酶素、胃复春均能有效调控血清中EGF含量；安胃汤大剂量组EGFR值与空白对照组EGFR值最为接近，两组比较差异无显著意义（P＝0.326>0.05）,且安胃汤大剂量组与维酶素组、胃18··· ·复春组比较差异有显著意义（P＝0.043，P=0.013<0.05），中、小剂量组与维酶素组、胃复春组之间胃黏膜中EGFR含量比较无显著差异（P>0.05）。说明，安胃汤大剂量组对患者的疗效最好。1.1实时荧光定量PCR结果2.1总RNA的浓度测定紫外分光光度计检测总RNA显示，A260/A280值为1.6~1.8，总RNA的浓度浓度符合实验要求。2.2标准曲线及荧光定量扩增曲线结果实验中，目的基因和内参基因的标准曲线均由荧光定量PCR仪附带软件绘制，线性关系良好（见图1），保证扩增结果的准确性。荧光定量扩增曲线光滑（见图2），说明扩增反应呈指数扩增。图1标准曲线图图2荧光扩增曲线图2图3：EGF电泳结果19··· ·图4:EFGR电泳结果3讨论1.1现代医学对慢性萎缩性胃炎的认识CAG与胃癌的发生有着密切的关系，尤其是胃窦萎缩性胃炎与肠型胃癌的关系较为肯定，世界卫生组织(WHO)将其列入癌前状态或癌前疾病的范围[6]，当其伴有胃粘膜不典型增生和肠上皮化生时，则属于胃癌前病变，经过一个漫长的，多阶段、多基因的变异积累过程可发展成胃癌[7]。CAG的癌变率为10%～19%，在胃粘膜癌前病变中占有重要地位。我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二，病死率居各类恶性肿瘤之首，在老年人群中胃癌的病死率有增加的趋势[8]。从慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生及异型增生到胃癌的演变过程已经明确，早诊早治是目前提高胃癌存活率的惟一有效措施。所以减缓甚至逆转CAG的发生发展，显得尤为重要和紧迫，但迄今为此，实质意义上抗CAG的药物投入临床应用极少[9]。CAG病因学尚未完全阐明，一般认为与周围环境的有害因素及易感体质有关。物理性的、化学性的、生物性的有害因素长期反复作用于易感人体即可引起本病病因持续存在或反复发生即可形成慢性病变。①物理因素长期饮浓茶、烈酒、咖啡、过热、过冷、过于粗糙的食物，可导致胃黏膜的损伤。②化学因素长期大量服用非皮质激素类消炎药如阿司匹林、吲哚美辛等可抑制胃黏膜前列腺素的合成，破坏粘膜屏障；烟草中的尼古丁不仅可影响胃黏膜的血液循环，还可导致幽门括约肌功能紊20··· ·乱，造成胆汁返流；各种原因的导致反流均可破坏粘膜屏障。③生物因素细菌尤其是幽门螺杆菌（helicobacterpylori，HP）感染与慢性萎缩性胃炎密切相关，90%以上的慢性萎缩性胃炎有HP感染，HP为革兰阴性微需氧菌，3umx0.5um大小呈弯曲螺旋状，一端带有2~6根鞭毛，仅寄居于胃上皮细胞表面，在胃小凹上部胃上皮表面和粘液层中最易找到，亦可侵入到细胞间隙中，其致病机制尚未完全清楚，可能与以下因素有关：1.HP产生多种酶如尿素酶及其代谢产物氨、过氧化氢酶、蛋白溶解酶、磷脂酶A等，对粘膜有破坏作用；2.HP分泌的细胞毒素如含有细胞毒素相关基因和空泡毒素基因的菌株，可导致胃黏膜细胞的空泡样变性及坏死；3.HP抗体可造成自身免疫损伤。④免疫因素慢性萎缩性胃炎患者的血清中能检出壁细胞抗体（parietalcellantibody，PCA），伴有恶性贫血者还能检出内因子抗体（intrinsicfactorantibody，IFA）。壁细胞抗原和PAC形成的免疫复体在补体参与下，破坏壁细胞。IFA与内因子结合后阻滞维生素B12与内因子结合，导致恶性贫血。⑤其他慢性萎缩性胃炎的发病率随年龄而增加，胃黏膜营养因子（如胃泌素，表皮生长因子等）缺乏，或胃黏膜感觉神经终器对这些因子不敏感，可引起胃黏膜萎缩。心力衰竭、肝硬化合并门脉高压、营养不良都可引起慢性萎缩性胃炎。糖尿病、甲状腺病、慢性肾上腺皮质功能减退和干燥综合征患者同时伴有萎缩性胃炎者亦较多见。胃部其他疾病如胃液、胃息肉、胃溃疡等也常合并慢性萎缩性胃炎。遗传因素也受到重视。目前现代医学关于慢性萎缩性胃炎尚无特效疗法，能找到病因者应进行病因治疗。①饮食宜易消化无刺激性的食物，少吃过酸过甜食物及饮料，忌烟酒、浓茶、咖啡，进食细嚼慢咽等。②抗菌幽门螺杆菌阳性者可给予以铋剂为主的三联疗法如枸橼酸铋钾，阿莫西林，甲硝唑，也可给予质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂加两种抗菌药为主的三联疗法。青霉素过敏者可用克拉霉素、四环素、庆大霉素、呋喃唑酮等，对甲硝唑胃肠反应不能耐受者可改用替硝唑。李兆申[10]强调根除幽门螺旋杆菌的21··· ·重要性，根除幽门螺旋杆菌有可能提高其逆转率。除此之外尚要注意抗酸、抑酸，调整动力，改善与加强胃粘膜的保护机制等综合措施。③对症治疗萎缩性胃炎以对症治疗为主，有消化不良者可给予胃黏膜保护剂如硫糖铝；腹胀、恶心、呕吐者可给予胃肠动力药如甲氧氯普胺，多潘立酮或西沙必利；有胆汁返流者可给予硫糖铝及胃肠动力药以中和胆盐，防止返流；伴恶性贫血者可给予维生素B12和叶酸；有肠腺化生者可给予重要胃复春，猴菇菌片及维生素等。对有肠腺化生和不典型增生者应密切随访，一般6-12个月复查胃镜一次。④外科手术适用于伴重度不典型增生或重度肠腺化生，尤其是不完全性大肠腺化生者。1.1中医对慢性萎缩性胃炎的认识慢性萎缩性胃炎伴发的肠上皮化生和异型增生,是胃癌的癌前病变。胃私膜发生癌变并非由正常细胞一跃而成癌细胞,而是由慢性胃炎胃勃膜萎缩肠上皮化生一异型增生一胃癌,防止肠上皮化生和异型增生的进一步发展或逆转其病理改变是进行胃癌二级预防的有效措施。我们认为慢性萎缩性胃炎依其症状属中医“胃痞”、“胃院痛”范畴。其发生与脾、胃、肝等脏腑的功能失常有关,但是最基本的病机在于脾胃二脏。慢性萎缩性胃炎的发生多因饮食所伤、情志不舒,导致肝胃不和,升降失职,浊邪内停日久则脾失健运,水湿不化,郁而不解,蕴积成热,热塑血痕而成毒,热毒伤阴,浊毒淤阻胃络,导致胃体失去滋润,胃腺萎缩其病因多由饮食劳倦，损伤脾胃；或肝郁气滞，胃失和降，胆汁反流入胃；或禀赋不足，脾胃虚弱以致湿热内蕴，灼伤胃膜；或气机阻滞，血流不畅，胃失濡养，致黏膜灰白，黏膜下血管显露。其病机主要为脾胃虚弱，纳运失常，生化乏源，气机失畅，痰湿内蕴，久之胃络自痹，气血运行受阻，胃失荣养，渐而黏膜萎缩。1.2中医对慢性萎缩性胃炎的临床认识李军祥[11]CAG癌前病变属中医“胃痞”范畴,其病位在胃,与肝脾关系密切,病性属虚实相兼,病程绵长,病情迁延反复难愈,胃为多气多血22··· ·之腑,气行则血行,气虚则血瘀,日久则影响气血运行形成气虚血瘀证,临床上中医运用益气活血法治疗CAG癌前病变取得了较好的疗效,能够改善胃黏膜血液循环,促进胃黏膜病变的修复。莫剑波等[12]枳实消痞丸治疗胃癌前病变30例，总有效率86.70%。田胜利等[13]采用升清降浊治疗CAG时，佐用益气养阴药，不仅能补脾胃之虚，复其升降的生理功能，而且能防止辛味药耗气伤血；临证发现即使CAG患者气阴两虚指征不明显，适当予以益气养阴药物，可防止升清降浊所用之辛、苦味药的伤阴寒凝之弊，非但不影响疗效，反而能够更快地改善症状。余瑞英等[14]以玉竹黄精汤为主加味治疗慢性萎缩性胃炎合并肠上皮化生和异型增生患者48例，气虚加生黄芪、淮山药；湿热加黄芩、川连、生甘草；肝郁气滞加柴胡、郁金；疗程3个月，临床总有效率为89.5%；肠上皮化生治愈率为50%；不典型增生治愈率为42.1%。王钢等[14]报道分别采用胃宁汤Ⅰ(黄芪、蒲公英、党参、麦冬、焦山楂、乌梅、三棱、莪术、香橼、佛手、川椒、炙甘草)和胃宁汤Ⅱ(蜈蚣、人参、麦冬、莪术、五味子)治疗气阴两虚、血瘀气滞型及阴虚血瘀型CAG患者181例，有效率为86.6%和86.9%，说明益气养阴活血中药不仅能保护和修复胃黏膜，改善临床症状，还可阻止或减缓CAG的病理进展。杜艳茹等[15]胃康饮治疗胃癌前病变98例，总有效率91.8%。裴林等[16]疗慢性萎缩性胃炎伴肠化生及不典型增生66例，用增生消胶囊（红景天、绞股蓝、田基黄、蛇莓、薏苡仁、枳实、白术、川芎、当归等）治疗，3个月为1个疗程，共2个疗程。总有效率为93.7%；肠上皮化生的治愈率为47.0%。曹志群等[17]用芪莲舒痞颗粒治疗胃癌前期病变患者61例，设维酶素对照组36例，结果：①综合疗效：治疗组为80.3%，对照组为47.2%，差异有显著性(P<0.05)；②治疗组治疗前后自身及与对照组比较，临床症状积分、胃镜像、病理积分均有显著差异(P<0.05)。梅建强等[18]胃痞汤（柴胡、黄芩、当归、白芍、蒲黄、五灵脂、瓜蒌、蒲公英、仙鹤草、半夏、茵陈、鸡内金、三棱、败酱草、苦参、白花蛇舌草、茯苓、麦冬、荔枝核、半枝莲、三七粉等）治疗胃癌前病变43例，23··· ·以中医辨证分型用药作对照组43例，结果：治疗组总有效率97.67%，对照组总有效率90.70%，无显著性差异(P>0.05)；不典型增生的有效率，治疗组为86.05%，对照组为65.12%，有非常显著性差异(P<0.01)。袁红霞等[19]用善胃方(太子参、黄精、石斛、天花粉、白花蛇舌草等)治疗气阴两虚型CAG伴胃黏膜异型增生患者30例，发现中药组治疗后，肠化、不典型增生均有改善，且能降低表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)的蛋白表达水平，从而阻断癌前病变细胞的恶性增殖。李郑生[20]以香砂温中汤治疗121例脾胃气虚的CAG患者，生化检测发现患者的异柠檬酸脱氢酶(ICD)、乳酸脱氢酶(LDH)、补体C3、IgG升高，而17-羟类固醇(17-OHCS)、儿茶酚胺(CA)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)含量下降。赵强等[21]发现善胃方能使气阴两虚型CAG伴胃黏膜异型增生患者的抑癌基因蛋白p16的表达增加、癌基因蛋白p21的表达降低。陆为民等[22]究益气健脾、活血消痞中药胃舒胶囊能使CAG患者的相关嗜银蛋白(AgNOR)颗粒数显著降低，抑制增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。1.1中医对慢性萎缩性胃炎的相关动物实验研究赵玉斌[23]等用化浊和胃方（蕾香、佩兰、砂仁、白花蛇舌草、半枝莲、半边莲等）,阻断大鼠癌前病变，结果发现化浊和胃方可降低CAG合并癌前病变大鼠组织增殖水平，有良好的阻断作用，该作用可能与下调PLGC组织中与细胞增殖相关的EGFR蛋白及mRNA的表达有关。高绍芳[24]等用化浊和胃方对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜CyclinD1、PTENmRNA表达的影响。结果发现化浊解毒和胃方可以改善和逆转癌前病变大鼠胃黏膜的病理改变，其作用可能与影响胃黏膜组织CyclinD1、PTENmRNA的表达有关。孙宁[25]黄芪建中汤对脾虚型慢性萎缩性大鼠胃黏膜病理形态学改变具有明显的复健作用，对大鼠的胃液分泌，调节胃肠运动，增加小肠免疫方面有着显著改善作用，对大鼠的外周血红细胞计数、血红蛋白、红细胞平均血红蛋白及血小板计数显著提高并接近正常值，对微量元素Fe、Zn、Mg的含量也显著改善。该方不但直接改善了胃黏膜24··· ·的血供，使组织营养状况得以改善，促进了组织修复，还能有效提高胃黏膜前列腺素E2(PGE2)含量，保持了胃黏膜微血管的完整性，加快胃小凹干细胞增殖移行修复胃黏膜上皮的速率，使胃黏膜屏障功能恢复正常，达到了治疗作用。赵岩[26]颗粒治疗慢性萎缩性胃炎大鼠，发现萎胃康颗粒能改善胃粘膜的萎缩，对治疗慢性萎缩性胃炎具有良好的作用。胡鸿毅[27]饮预防和治疗慢性萎缩性胃炎大鼠，发现胃祺饮能明显阻断有害因素对粘膜的炎症损伤，改善病变组织粘膜萎缩程度，可提高GSH-Px水平，阻断NO的过度产生，下调组织中EGF及EGFR水平，有效地消除多种有害因素对胃粘膜的诱癌作用。王少明[28]胃炎1号方治疗CAG大鼠能改善胃私膜的萎缩，对胃私膜的炎症也有抑制作用。任学军等[29]胃二号方(黄芪、党参、扁豆、米仁、丹参等)能显著提高CAG大鼠的血清胃泌素及胃窦黏膜D细胞的数量，从而促进胃黏膜的修复。杜群等[30]活血化瘀中药(丹参、赤芍、川芎、莪术)能抑制CAG大鼠的AgNOR、PCNA的表达，降低凋亡指数，说明活血化瘀中药能抑制细胞增殖及凋亡是其治疗CAG的机制之一。黄妙珍等[31]报道了补气养阴解毒方(党参、白术、茯苓、熟地、山药、半枝莲等)能降低CAG大鼠血清EGF和血浆生长抑素(SS)的水平，从而防止胃黏膜的萎缩。姜惟等[32]研究发现：半夏泻心汤能增加慢性胃炎合并幽门螺旋杆菌(HP)感染大鼠血清白细胞介素-2(IL-2)含量，降低白细胞介素-4(IL-4)的含量，对慢性胃炎合并HP感染大鼠有显著协调TH1和TH2细胞平衡的作用，实现对机体的免疫调节，从而达到清除HP的目的。对于临床HP感染性胃病的治疗具有十分积极的意义。袁静等[33]选取足三里、中脘、天枢，每次30分钟，左右交替，连续治疗2月。结论示针灸对CAG有肯定疗效，其中在改善症状方面有很大优势，绝大多数患者经治疗后，自觉症状有不同程度改善，甚至消失。针刺或针灸治疗后患者腺体萎缩，肠腺化生程度均有不同程度的发送，提示针灸对CAG病理变化有逆转的可能性。治疗观察中，未发现任何不良反应，提示针灸治疗对CAG安全可靠。张业等[34]察了穴位贴敷对CAG大25··· ·鼠胃黏膜血流量、PGE2的影响，结果显示：穴位贴敷可以改善大鼠一般状态及体重，增加胃黏膜血流量及胃黏膜PGE2，其作用优于药物对照组。认为穴位贴敷对胃黏膜确有保护作用，是临床治疗CAG的有效方法之一。高希言[35]通过针刺、艾灸慢性萎缩性胃炎模型大鼠“足三里”、“中脘”、“天枢”穴，发现针灸可提高胃粘膜组织前列腺素E(PGEZ)、前列腺素Fz(PGFZ)、cAMP含量，降低GMP含量。故针灸对胃粘膜具有细胞保护作用，改善微循环，增加胃黏膜血流量，加速炎症细胞吸收和消散，促进胃黏膜再生，有效逆转胃黏膜萎缩、肠化生及异型增生，增加组织器官的血氧供应、促进胃黏膜再生作用。1.1对MNNG大鼠慢性萎缩性胃炎模型的评价目前，国内外制备萎缩性胃炎动物模型的方法较少，主要有3种：(1)生物制模法，即以Hp感染动物；(2)多种各类理化因子同时反复损伤胃粘膜形成慢性炎症的模型；(3)免疫因素制模法，形成自体免疫性胃炎模型。现有的制造萎缩性胃炎动物模型的研究方法多为多因素造模，造模方法复杂、或造模因素较多，或造模时间较长，使模型推广、应用受到限制。MNNG是一种广谱强致癌剂，其同类物在自然界广泛存在。在动物实验中，已证实可诱发大鼠、狗等的胃腺癌，本实验为了增加制作慢性萎缩性胃炎的成功率及组织学上的相似性，选用了Wistar雄性大鼠。本实验采用MNNG喂养Wistar雄性大鼠，低剂量饮用水喂养8周，而后停止用药。事实证明，耐药性和造模成功率都比较令人满意。实验证明用MNNG制作大鼠慢性萎缩性胃炎模型，操作简单，同时在取材时有效的避免了非特异性损伤，是其它研究所不具备的优点，并获得组织学上更接近人慢性萎缩性胃炎的动物学模型。1.2关于表皮生长因子极其受体的讨论表皮生长因子（EGF）定位于细胞质，主要集中胃腺颈部，是参与粘膜修复的重要因素。国内外对此家族成员的原型EGF的生物活性及其消化道生理病理的研究已取得了显著的进展，EGF是一种重要的生物活26··· ·性肽，是由53个氨基酸残基组成的小分子多肽类生长因子，对酸和热有一定耐受性，其不仅在血液中能检出，还广泛存在消化道内，消化道内的EGF主要来源于颌下腺和十二指肠Brunner′s腺[36]。EGF是一种具有抑制胃酸分泌，促进上皮增殖，组织修复和细胞保护作用的内源性物质，在保护胃黏膜免受损伤因子破坏，维持胃肠黏膜完整性方面起着非常重要的作用。是近年发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的分子。它能抑制胃酸分泌和促进组织、在体内、体外均能刺激多种细胞内DNA、RNA及蛋白质的合成，促进上皮增殖，组织修复和细胞保护作用，在保护胃粘膜免受损伤因子破坏，维持胃肠粘膜完整性方面起着非常重要的作用，另有作者认为胃粘膜也具有产生EGF的能力,胃液中的EGF很可能是人体对粘膜受损时的一种应答平衡反应[37]。胃肠道的任何部位的粘膜受损都会诱导干细胞形成新的EGF分泌细胞体系,分泌大量EGF,从而刺激细胞增殖、再生,促进粘膜修复[38]。靶细胞膜上特异性受体(EGFR)定位在胞浆及胞膜，但以后者为主，在胃腺颈部、基底部都有表达。阳性表达以胃黏膜的壁细胞、颈部细胞为主。EGFR是一带有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,是EGF、TGFa的共同受体,是原癌基因C-erbB的表达产物。EGFR广泛存在于胃肠黏膜上皮层,平均每个上皮细胞约5000~10000个受体,见于胞膜和胞浆,以胞膜为主,其在应激所致胃肠道损伤后的修复过程中,不仅传递EGF家族的生物学活性而且倡导它们的完全表达,同时可提高损伤部位附近EGFR数目,从而促进黏膜上皮损伤的修复[39]。。EGFR表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在恶性肿瘤中高表达。EGFR在应激状态下胃黏膜耐受性细胞保护中起重要作用，但在正常组织中含量很低，表达异常可导致正常细胞转化成无限增殖的肿瘤细胞，在许多肿瘤组织中常有过度表达。EGF和EGFR能够促进正常细胞的恶性转化及刺激肿瘤细胞的增殖，并与胃癌的淋巴结转移及预后有关。有研究表明，EGFR在胃黏膜各病变组织中均有表达，在浅表性胃炎中的低表达可能起胃黏膜的修复作用，在萎缩性胃炎以后27··· ·的持续增加，从促进正常细胞的恶性转化到癌前病变的高表达，则导致正常细胞转化成无限增殖的肿瘤细胞，最终发生癌变。TGF-a是一种多肽促细胞分裂剂，通过自分泌或旁分泌与EGFR结合后，激活受体上的酪氨酸激酶，提供持续分裂信号至细胞内，促使细胞内DNA的合成，引起细胞增殖、分化。其与EGF特异性结合，促进细胞分裂和增殖，使机体上皮组织增生。正常胃黏膜组织中未见EGFR表达，在癌前病变中EGF和EGFR有较高的阳性率，随着异型增长程度的加重，阳性率呈上升趋势，表明EGF和EGFR参与了胃黏膜的癌变过程[40-42]。本实验表明安胃汤通过降低EGF及EGFR在血液中的表达，改善微循环，增加胃黏膜血流量，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，从而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。1.1关于RT-PCR的相关问题讨论Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-timePCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无需再扩增后进行操作。1.2安胃汤理法方药的研究在中医学理论中无“慢性萎缩性胃炎”一词，但根据慢性胃病病程进展全过程的临床表现：食欲减退、恶心、嗳气、上腹部饱胀或钝痛，少28··· ·数病人可发生上消化道出血、消瘦、贫血、脆甲、舌炎或舌乳头萎缩等。基本类似于中医学“胃痞”、“胃脘痛”、“腹胀”等范畴。胃痞（痞满）之名首见于《内经》，称为否、满、否塞、否膈等。如《素问·五常政大论》曰：“备化之纪……其病否”，“卑监之纪……其病留满否塞”等。《伤寒论·辨太阳病脉证并治》明确痞的基本概念：“但满而不痛者，此为痞”。《诸病源候论·痞噎病诸候·诸痞候》提出“八痞”、“诸痞”之名。《景岳全书》中以“痞满”之名立专篇，自此痞满的病名趋于一致。症状方面，《素问·至真要大论》曰：“太阳之复，厥气上逆……心胃生寒，胸膈不利，心痛否满”，指出了本病胸膈满闷，心下痞塞的症状。类证鉴别方面，《丹溪心法·痞》把痞满与胀满作了区分，认为二者相类似而痞满轻，胀满重，所言“胀满内胀而外亦有形，痞则内觉痞闷，而外无胀急之形”，较为中肯。《素问·异法方宜论》曰：“脏寒生满病”。《素问·至真要大论》云：“太阳之复，厥气上逆……心胃生寒，胸膈不利，心痛否满”、“诸湿肿满，皆属于脾”。《素问病机气宜保命集》云：“脾不能行气于脾胃，结而不散，则为痞。”指出本病的病因病机涉及饮食不节、起居不时、寒邪为患、脾胃虚弱等方面，主要病变脏腑在于脾胃。张仲景对痞满的认识进一步深化、具体，如《伤寒论·辨太阳病脉证并治》云：“脉浮而紧，而复下之，紧反入里，则作痞，按之自濡，但气痞耳”，“太阳病，发汗，遂发热恶寒，因复下之，心下痞”。《伤寒论·辨太阳病脉证并治》亦云：“胃中不和，心下痞硬，干噫食臭”，“谷不化，腹中雷鸣，心下痞硬而满”，指出痞满的发生与食滞中阻有关，是由于暴饮暴食，恣食生冷，食谷不化，阻滞胃脘，痞塞不通所致。《兰室秘藏》曰：“脾湿有余，腹满食不化”，“或多食寒凉，及脾胃久虚之人，胃中寒则胀满，或脏寒生满病”，认为痞满的生成是由于脾胃失健，水湿不化，酿生痰浊，痰气交阻，中焦气机不利，升降失司所致。《景岳全书·痞满》有：“怒气暴伤，肝气未平而痞”，认为痞满的生成是由于七情失和所致。《诸病源候论·否噎病》曰：“夫八否者，荣卫不和，阴阳隔绝，而风邪外入，与卫气恚气积，或29··· ·坠堕内损所致。其病，腹内气结胀满，时时壮热是也。其名有八，故云八否。”，提出引起痞满的原因非只一端，概其病机，不外乎营卫不和，阴阳隔绝，气血壅塞，升降失常。金代李东垣提倡脾胃内伤之说，其所论脾胃病的致病原因，如饮食不节，劳逸过度，喜怒忧恐皆与本病有关。《丹溪心法·痞》中认为：“痞者与否同，不通泰也”，“脾气不和，中央痞塞，皆土邪之所为也”，强调本病病位在脾胃。明清医家在汇集前贤论述的基础上作了必要的补充，如李中梓《证治汇补·痞满》认为：“有湿热太甚，土来心下为痞者，分消上下，与湿同治。”提出以感受湿热之邪，阻滞中焦为发病机理的观点。由此可见，古代医家所论痞满的病因病机有饮食不节、起居不时、寒气侵犯、表邪内陷、湿热所侵、情志不和、痰气搏结以及脾胃内伤等方面，所涉及的脏腑有肝、脾、胃等。并充分考虑到了患者的体质在发病中的影响。安胃汤是由半夏泻心汤、芍药甘草汤、丹参饮及百合汤等方化裁组合而成。具有消痞和胃、理气化湿之功，在临床应用多年，疗效显著。方中半夏入胃为君，能和胃降逆，燥湿开结，消痞除满；黄连泻火解毒，干姜温中逐寒，二药同用，寒热并施，辛开苦降；百合味甘而性凉能清泻胃腑之邪热，养护胃气；乌药顺气开郁，散寒止痛，配合百合，则养津护胃而无滋腻之虑，行气散寒而无温燥之虞；白芍、炙甘草酸甘化阴以生津液，柔肝缓急而止疼痛；丹参、木香行气滞而化血瘀；薏苡仁，健脾清热。本方取半夏泻心汤调和脾胃治痞满，芍药、甘草汤缓急止痛，丹参饮、百合汤调和胃之气血津液，使胃气复于通降，药物组成，大多配对而用，其功用相反相成，相得益彰，是和与降的统一，燥与润的结合，体现了调理胃气为主，兼顾脾肝的治疗原则。1.1药理研究：半夏的主要有效成分为生物碱，以麻黄碱为测定成分，计算总生物碱含量。除生物碱外，尚含有半夏淀粉(约75.74％)、脂肪酸，含有B-谷甾醇，氨基酸，葡萄糖苷，半夏胰蛋白酶抑制物，胆碱，微量鸟苷，次30··· ·黄嘌呤核苷等，能调节胃肠道功能，半夏中的直链淀粉有抗炎、抗肿瘤作用，有显著的抑制胃液分泌和胃液酸性成分的变化。黄连的有效成分黄连素（小檗碱），具有广谱抗菌能力，极低浓度即开始阻止革兰氏阳性菌和肠伤寒菌等革兰氏阴性菌的作用，此外，对蜡样芽胞杆菌、枯草杆菌等动物病原菌以及念珠菌属等真菌均有抗菌性。低浓度时兴奋胃肠平滑肌，高浓度时则呈现解痉作用，黄连素和黄连甲醇对胃黏膜具有保护作用。干姜的有效成分干姜醇和干姜醚，其中干姜醇具有明显的抗炎作用，干姜浸剂能抑制应激性溃疡与抑制胃液分泌和降低胃液酸度。干姜醚提物能对抗水浸应激性、吲哚美辛加乙醇性、盐酸性和结扎幽门性胃溃疡的形成，能对抗蓖麻油引起的腹泻，水提物能对抗结扎幽门性溃疡形成。百合含有多种微量元素、氨基酸、皂苷类、磷脂类、多糖类、生物碱类等，具有抗癌作用，从百合鳞茎中提出的一种生物碱，是有丝分裂毒素的一种典型代表，能抑制癌细胞的增殖，临床上用以治疗癌症。乌药含有糖类、酚类、鞣质、氨基酸、蛋白质、生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素、内酯、甾体等化学成分，对胃肠平滑肌具有双重作用，能增加消化液的分泌。白芍的有效成份白芍总苷（TGP），TGP可以降低血浆中转氨酶水平，病理检查也发现其可以明显降低肝组织坏死的范围及程度，减少炎细胞浸润，同时发现TGP可以降低肝匀浆中升高的MDA水平，使降低的肝匀浆SOD、GSH-Px酶活性增强而发挥护肝作用。具有有益血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳的功效,增强人体免疫功能和镇痛作用并具有解痉作用。甘草的有效成分甘草甲醇、甘草素、异甘草素对胃肠道平滑肌有明显解痉作用，能调节机体免疫功能，具有抗炎、抗肿瘤作用；甘草锌有一定的抗应激和抗炎的作用，甘草总甙尚具有抗氧化作用；白芍甘草单用及合用对离体兔肠管运动有明显的抑制作用。丹参的主要有效活性成分是丹参酮型的二萜醌类化合物,可以保护31··· ·肝细胞，通过促进肝细胞的再生、抗肝纤维化及改善肝血液循环来达到其对肝纤维化的治疗作用。丹参有确切的抗菌消炎作用，能增加胃粘膜血流和电位差，减少氢离子的逆扩散，有保持粘膜屏障完整性，增强其防御功能的作用,具有增加胃窦部和体部黏膜的血流量，具有保护黏膜屏障完整性，增强其防御机能的作用。木香的主要成分是木香内酯。对小肠平滑肌有较好的解痉作用，解痉作用属向肌性，对肠有轻度兴奋作用，对乙酰胆碱、组胺与氯化钡所致肠痉挛有阻滞作用。可升高血浆MLT水平，具有抗溃疡、抗炎作用，对肠痉挛有对抗作用。薏苡仁的有效成分是苡仁提物和苡仁丙酮，有温和的镇痛抗炎作用。对癌性疼痛及炎症反应有一定的缓解作用，均有降血糖、抗癌作用[42]。1.1安胃汤促进胃黏膜逆转机制的探讨2.19.1本实验表明安胃汤对慢性萎缩性胃炎具有很好的治疗效果，具有如下作用：①改善胃黏膜组织病理形态；②EGF及EGFR具有促进上皮增殖，组织修复和细胞保护作用，在保护胃黏膜免受损伤因子破坏，维持胃肠黏膜完整性方面起着非常重要的作用，安胃汤可以调控EGF及EGFR的表达水平，改善胃黏膜状态，促使胃黏膜修复。2.59.2安胃汤可能通过降低EGF及EGFR在血清中的表达，改善微循环，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，表明安胃汤可通过促进或稳定胃黏膜上皮细胞膜EGFR水平来促进胃黏膜组织的愈合，从而达到治疗慢性萎缩性胃炎的目的。3.9.3安胃汤能提高机体免疫功能，根除幽门螺旋杆菌，改善胃黏膜血流，增强胃粘膜细胞的保护作用，促进氧自由基清除，提高抗氧化能力；促使炎症吸收，有利于胃粘膜的修复和腺体萎缩、肠化的逆转。方中的各种中药相互作用与协调，构成安胃汤对CAG疗效的产生。4存在的问题和展望一、相关资料表明，很多慢性胃炎动物模型种类繁多，形成机制各异，32··· ·科研选择模型各有不同，造模成功率以及模型大鼠的个体差异影响到实验结果，并缺乏统一公认的标准，致使中药复方的实验研究结果不能和相关实验结果进行比较，而对综合法制备的动物模型，各种致病因素以及其治疗原理之间的关系，在制模过程中所起作用的大小也难以相互比较，在动物模型缺乏统一标准的情况下,实验结果的数据难以表明其科学性和严谨性。二、慢性萎缩性胃炎的辨证分型多种多样，究竟安胃汤是否对各种慢性萎缩性胃炎的治疗效果都好，还是仅仅对其中某一个或几个证型疗效显著，都受到动物实验其不足方面的限制，目前尚无法进一步证明。三、导致慢性萎缩性胃炎的发生因素有很多，而发病诸多原因之间又相互影响，所以作用机制也是复杂多样的。从历来的动物模型实验结果分析，安胃汤可加强胃黏膜保护因子，促进胃黏膜修复，从而使萎缩的胃黏膜细胞得到修复、逆转其丧失的功能结构。但因为科研经费等条件制约和限制，尚且未能从多个角度去探讨其作用机理，去进一步比较在CAG发生发展过程中各因素间的相互关系。如果能够结合现代医学的相关研究，希望进一步从药物分析，分子基因等层面上更深入探讨安胃汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机理。33··· ·结论1.1安胃汤对使实验性慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜组织的病理学形态有修复和改善作用。1.2安胃汤在降低血清中表皮生长因子及其受体表达水平方面，安胃汤大剂量组作用明显强于中、小剂量组，体现出一定的量效关系。1.3安胃汤在降低血清中表皮生长因子及其受体表达水平方面，安胃汤大剂量组作用明显强于维霉素对照组及胃复春对照组。1.4安胃汤可降低慢性萎缩性胃炎大鼠血清中表皮生长因子及其受体表达水平，这可能是安胃汤改善微循环，增强黏膜屏障的防御和修复的功能，从而达到产生胃黏膜保护作用、治疗慢性萎缩性胃炎的重要机理。34··· ·参考文献[1]MorsonBC，SobinLH，GrundmannE，etal.Precancerousconditionsandepithelialdisplasiainthestomach.Jclinpathol，1980，33：711[2]MarkPC,MillerJS.HelicobacterPyloriandgastricatrophycancerparo2doxes.JNatlCancerInstitute1995，87(23)：1731[3]焦建玮.化浊解毒方治疗慢性萎缩性胃炎的实验研究[D].河北医科大学，2009，3[4]王四旺，施新猷，黄传贵.中药药效学研究与评价.西安：陕西科学技术出版社，2001，25(5)：930~934[5]张秋霞，郭淑杰.四逆陷胸汤合方对治疗实验大鼠慢性萎缩性胃炎血清胃泌素、胃黏膜PGE2的影响.北京中医，2001，20(1)：37[6]朱阳春，李茂生，耿昌友.慢性萎缩性胃炎、胃黏膜上皮不典型增生与胃癌的相关性研究[J].中华消化内镜杂志,1998,15(3)：146~147[7]CorreaP,ShiaoYH.Phenotypicandgenotpiceventsingastriccarcinogenesis[J].CancerRes,1994,54:1941[8]孙秀娣，牧人，周有尚，等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测[J].中华肿瘤杂志，2004，26(1)：49[9]林寿宁，黄适.安胃汤对大鼠慢性萎缩性胃炎TFF表达的影响.广西中医，2006，21(2)：57[10]李兆申.全国慢性胃炎诊治研讨会纪要.中华消化内镜杂志.2004，23(2)：99[11]李军祥，张玉禄，等.益气活血法对大鼠萎缩性胃炎癌前病变差异基因表达谱的影响.世界华人消化杂志，16(29)：3261~3268[12]莫剑波，罗晋卿.加味枳实消痞丸治疗胃的癌前病变30例[J].四川中医，2002，20(6)：44~45[13]田胜利，何春梅.升清降浊法古法探新胃病治疗经验谈.上海中医药杂35··· 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·综述中医对慢性萎缩性胃炎及胃癌癌前病变的研究概况慢性萎缩性胃炎(chronicatrophicgastritis,CAG)是以胃黏膜上皮和腺体萎缩、黏膜变薄、黏膜肌层增厚并多伴有腺化生、不典型增生为特征的慢性疾病。临床多表现为胃脘痞满、疼痛、食欲减退、嗳气、泛酸等,属于祖国医学“胃痞”、“胃脘痛”范畴。慢性萎缩性胃炎被列为胃癌的癌前疾病或癌前状态,而在其基础上伴发的肠上皮化生和异型增生则称为胃癌的癌前病变。目前中医开展慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生和异型增生的治疗工作已有多年,众多的临床报道及病理证实,中药可使部分肠上皮化生和异型增生减轻和消失,从而扭转了胃癌癌前病变难以逆转的观点,使胃癌的药物预防成为可能。现就CAG癌前病变的中医药研究概况综述如下。1病因病机胃粘膜肠上皮化生与异型增生的病因学，目前尚不清楚。可能是环境因素，遗传因素，饮食习惯和食物搭配，胃腔的理化因素(如胃内胆汁返流等)，HP感染，精神神经因素，咽部及胃粘膜慢性炎症刺激等综合因素长时间作用相关。中医学对本病的病因认识目前趋于认同，认为其与饮食失调，饥饱不调，喜食热烫粗糙或辛肥油腻食物，或嗜酒吸烟，情志怫郁，忧思恼怒，禀赋不足，素体虚弱，邪毒内侵，久病体弱，劳倦内伤等致病因素密切相关。但对病机的认识，则各有仁智之见，朱君华等[1]认为其病机为脾胃气虚，湿热蕴结,胃络血瘀。庄建德[2]认为本病病机为脾气亏损,气滞血瘀毒聚。王璐琳[3]认为本病机为气虚血瘀。王道坤[4]认为本病病机为脾胃虚损为本，痰热互结为标，虚实错杂、寒热互结为其主要病理特点。通过近年的研究，对本病病机的认识已渐趋一致。病位在胃,与脾肝胆肾等脏腑相关。病理性质属本虚标实。本虚以脾胃气阴40··· ·两虚为主。标实则有气滞、血瘀、湿浊、热毒等。2临床治疗1.1辨证分型论治根据2002年《中药新药临床研究指导原则》将慢性萎缩性胃炎分为脾胃虚弱证,肝胃不和证、胃阴不足证、脾胃湿热证、胃络瘀血证5型。但各地医师根据自己的临床实践又有不同的认识。代二庆[5]等认为，从慢性萎缩性胃炎至胃癌癌前病变演变的过程中,早期多属于血瘀热毒,中期多属于阴虚有热，后期则属于气阴两虚。据此研制了相应的“善胃I-III号”中药制剂，以猴头菌片为对照组。研究发现“善胃I-III号”在临床症状改善、总体疗效方面优于对照组(P<0.005)。袁红霞[6]等在此基础上近一步探讨其逆转胃癌前期病变的分子机制，认为作用可能与抑制胃癌前期病变时胃黏膜EGF、EGFR、TGF2A的过度表达有关。尹光耀[7]等选用胃康复冲剂(黄芪、茯苓、白术、甘草等)加减治疗脾气虚、脾阳虚、脾阴虚、脾虚气滞四型胃癌癌前病变，以胃苏冲剂为对照组，结果发现轻中度肠化及异型增生治疗组疗效高于对照组，但不完全性结肠型化生2组间疗效无显著性差异。1.2固定方、基础方治疗健脾益气为主曹志群[8]等认为，通过修复与保护胃壁屏障的结构与功能,是健脾法防治胃癌癌前病变的重要作用环节。李春婷[9]等自拟仁术健胃颗粒(黄芪、白术、薏苡仁、莪术等)，以胃复春为对照组治疗胃癌癌前病变患者。结果治疗组肠化生及异型增生治疗总有效率均显著高于对照组,同时CEA、PCNA降低明显,血清SOD明显升高，脂质过氧化物明显降低,提示仁术健胃颗粒具有较好的抗氧化、清除自由基、抗细胞过度增殖等作用，能有效逆转胃黏膜癌前病变。陆为民[10]等对此进一步研究认为，仁术健胃颗粒可抑制癌基因的活化和抑癌基因的失活，促进胃癌前细胞的凋亡，根除HP减轻和削弱HP的毒力，调节血清一氧化氮(NO)水平，从而逆转胃癌癌前病变。41··· ·活血化瘀法为主张占海等[11]用胃安胶囊(健脾益肾、理气活血)治疗慢性萎缩性胃炎60例，临床观察表明对慢性萎缩性胃炎患者胃黏膜萎缩、炎症程度、肠化以及非典型增生有较好的治疗作用，对临床症状改善明显。胃安胶囊的总有效率为96.8%，高于对照组维酶素的75.9%，组间比较有显著差异(P<0.05)。郭光业等[12]用健脾活血汤(白术、茯苓、陈皮、川芎、五灵脂、当归、白花蛇舌草、厚朴等)治疗慢性萎缩性胃炎80例,维酶素对照组34例，结果临床有效率96.51%,胃镜有效率90.54%，病理有效率86.76%，分别高于对照组(70.59%、43.33%、33.33%)。舒肝健脾和胃法为主王少旭等[13]用香苏饮和左金丸加味治疗慢性萎缩性胃炎43例。总有效率90.1%，胃镜复查有效率62.3%。刘忠信等[14]以四逆散合香砂六君子汤舒肝健脾和胃，总有效率达90%以上。莫剑波[15]用加味枳实消痞丸,药用枳实、厚朴、党参、茯苓、白术、麦芽、郁金、白芍、半边莲等研末,炼蜜为丸,每丸7g口服,每次2丸,每日3次。对照组用香砂养胃丸口服,每次9g,每日3次。2组均服6月为1个疗程。共治疗30例,有效率分别为86.7%和66.6%。攻补兼施法为主樊冬香[16]等拟芪夏连棱汤(黄芪15g，太子参15g，白术15g，茯苓15g，生薏苡仁15g，半夏12g，黄连6g，白花蛇舌草15g，三棱12g，莪术12g，白屈菜15g，延胡索18g，玉竹10g，猴头菌15g，香椽皮12g)治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变，对照组服三九胃泰冲剂。治疗3月为1个疗程，有效率分别为90%、40%。史健[17]以益胃冲剂(黄芪、党参、枸杞子、当归、生地黄、白芍、麦冬、五味子、延胡索、莪术、黄连、甘草)治疗慢性萎缩性胃炎及癌前病变,全部患者均住院治疗1个疗程,其后5个疗程带药回家自服。每次15g,3次/d,1月为1个疗程。综合疗效分析,症状改善率为93%，胃镜及病理改善率为85%。3中西医结合治疗贾雅薇等[18]用中西医结合的方法治疗慢性萎缩性胃炎42例，对照组予口服常规量的维酶素、阿莫西林胶囊，治疗组在对照组的基础上加服42··· ·中药自拟方益胃汤:丹参20g、当归10g、白术15g、白芍药12g、云茯苓12g、柴胡6g、檀香10g、三七(粉)3g、白芨12g、黄连6g、枳壳15g、木香9g、焦山楂15g,加减：烧心患者加乌贼骨15g,炒栀子6g;寒盛去黄连加干姜9g；气虚加党参、黄芪各15g。总有效率为92.9%；对照组39例，总有效率64.1%。高楠等[19]以中西医结合治疗Hp阳性的慢性萎缩性胃炎，对照组：阿莫西林0.5g每天2次，甲硝唑0.4g每天2次,丽珠得乐22mg每天2次,叶酸5mg每天2次,疗程8周。治疗组在对照组用药基础上加服中药除痞养胃汤(党参15g，茯苓15g，莪术15g，吴茱萸6g，木香9g，甘草6g，黄精15g，山药30g，砂仁6g，川黄连6g，败酱草30g)8周后续用除痞养胃汤基本方研末冲服,每天2次,每次9g，共4周。3个月后观察疗效并随访1年，治疗组总有效率91.3%，对照组总有效率75.0%，治疗组疗效明显优于对照组。4针灸及其他疗法宁晓军[20]报道针挑治疗慢性萎缩性胃炎,取穴:上脘、中脘、章门、梁门、天枢、肝俞、脾俞、胃俞、足三里、阿是穴等,每次取1–2穴,采用挑摇法,每1–2d挑1次,每次挑1–2穴,6次为1疗程,1疗程未治愈者,休息5d，再行下个疗程。对照组服硫糖铝，每次1g；维生素B6，每次20mg，日3次，结果总有效率分别为80.23%，26.61%(P<0.01)。吴文忠等[21]采取艾灸结合穴位贴药治疗慢性萎缩性胃炎,外贴膏药的制作以养阴、健脾、行气为治则,选取党参、黄芪、石斛、蒲公英、砂仁等为主药,根据药物的不同组分分别采用水提或醇提法提取生物碱和挥发油,制成药膏。治疗组:取穴足三里(双)、中脘、天枢(双)、神阙。每个穴位上施以温和艾灸;对照组单纯采用穴位贴药,其取穴、用药均同治疗组。治疗组31例有效率为97%、对照组30例有效率为80%,两组比较差异显著(P<0.01)。陈德正等[22]穴位注射治疗慢性萎缩性胃炎103例,治疗组:取穴足三里、胃俞、肝俞。药物采用黄芪注射液、当归注射液。对照组：药物以口服胃宁冲剂为主,结合症状,配合西药吗叮琳、多酶片、胃复安和五肽胃泌素等治疗。症状,胃镜和病理疗效有效率:治疗组分别为93.07%、86.53%、82.69%;对照组分43··· ·别为84.31%、64.70%、54.90%,两组各疗效经均有显著或极显著差异,治疗组疗效优于对照组。5实验研究1.1直接修复胃黏膜胃癌前病变直接表现为胃黏膜的损伤。中药逆转代表胃黏膜宏观和微观损伤的多项病理、生化等指标,直接修复胃黏膜损伤,达到治疗胃癌癌前病变的目的。王茵萍等[23]研究穴注黄芪、当归注射液对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠超微结构的影响时,发现该种穴注法可明显逆转细胞线粒体退变,增加粘原颗粒,缩小上皮细胞间隙,保护胃黏膜屏障而逆转癌前病变。1.2抗氧化作用的研究樊纪民[24]等以环磷酰胺诱发小鼠骨髓多染红细胞微核形成,而后予胃萎灵(乌梅、细辛、干姜、桂枝等)灌胃,结果发现,胃萎灵可明显降低微核形成率,提高小鼠肝脏谷胱甘肽转移酶活性及谷胱甘肽含量,并显著抑制巴豆油诱发的鸟氨酸脱羧酶活性及肝线粒体脂质过氧化,使线粒体活性增高,脂质过氧化物丙二醛生成减少,提示胃萎灵具有一定的抗突变作用,能清除机体内自由基。有关细胞增殖及基因表达的研究胡运莲[25]等使用免疫组化法研究加味左金丸对大鼠胃癌前病变胃黏膜EGFR、VEGF、C-met、Bcl–2、P53表达的影响,结果:EGFR、VEGF、Bcl–2蛋白表达明显低于自然恢复组(P<0.05或P<0.01),从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,进而发挥治疗大鼠胃癌前病变的作用,而对C–met表达无影响。对胃肠道激素的影响邵荣世[26]等研究发现胃宁茶(由紫苏、白豆蔻、莪术、黄连等组成)高、中、低剂量组与大鼠慢性萎缩性胃炎模型组比较，胃宁茶袋泡剂能降低血清胃泌素含量(P<0.01),提高胃黏膜PGE2水平(P<0.01)和cAMP含量(P<0.05),降低cGMP含量(P<0.05),改善胃黏膜血流量(P<0.05),减轻胃黏膜病理改变(P<0.05),促进胃排空(P<0.01)。说明胃宁茶袋泡剂是通过调节胃肠道激素,调整免疫功能,加强胃黏膜屏障,44··· ·改善胃黏膜血流,减轻炎症发生及腺体破坏,逆转上皮增生和肠化生,促进胃肠蠕动,加快胃排空及胃动力功能恢复而达到治疗目的。6问题与展望综上所述,目前有关慢性萎缩性胃炎的病因病机总体认为正虚为本，邪实为标，虚实夹杂,寒热错杂,具体地说是脾胃肾虚为本，气滞、血瘀、湿热为标。在治疗上强调健脾益胃为主，结合理气、活血、清热、祛湿等治法。目前中医治疗慢性萎缩性胃炎的方法很多，疗效较肯定，能使胃黏膜腺体萎缩、中重度肠化生与异型增生的病变逆转，总结出了不少行之有效的经验,已受到国内医学界的重视,但还存在许多问题亟待解决。主要包括以下几个方面:①临床辨证分型、疗程长短、疗效差别较大,临床疗效评定标准不统一，给临床和科研造成不便；②临床科研设计欠严密，缺乏大样本的随机对照、双盲研究,疗效的重复性差；③许多治疗只停留在临床观察阶段，对中药作用机理的实验研究不足，使得中药治疗缺乏可靠客观的理论依据；④需进一步探讨CAG的辨证论治规律，加强有效方药的筛选和验证，统一诊断与疗效标准,统一治疗方案。此外搞好剂型改良，研制出服用、携带方便的剂型，能使对CAG的临床研究提高到一个新水平。参考文献：[1]朱君华,林馨.胃宁汤治疗慢性萎缩性胃炎癌前病变的临床观察[J].浙江中医杂志,2001,(8)：342~343[2]庄建德.浅谈中药治疗胃粘膜肠上皮化生与非典型增生[J].河南中医学院学报,2004,5(1)：110[3]王璐琳,吴鹏.谈慢性萎缩性胃炎癌前病变的中医治疗[J].新疆中医药,2003,6(5)：5[4]路志鹏.王道坤教授诊治慢性萎缩性胃炎胃癌前期病变经验[J].甘肃中医学院学报.2004,3(3)：2~4[5]代二庆,赵占考,袁红霞,等.善胃I–III号方治疗慢性萎缩性胃炎胃癌前45··· 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·广西中医学院研究生学位论文作者声明本人声明:本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研究成果。对前人及其他人员对本文的启发和贡献已在论文中作出了明确的声明，并表示了谢意。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人和其它机构已经发表或者撰写过的研究成果。导师及本人同意学校保留本人学位论文并向国家有关部门或资料库送交论文的复印件或者电子版，允许论文被查阅和借阅，并授权广西中医学院可以将本人学位论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复制手段和汇编学位论文（保密论文在解密后应遵守此规定）。作者签名:导师签名:日期:2010年5月28日50··· ·个人简历姓名:朱光辉性别:男出生年月:1983年3月16日民族:汉族籍贯:河南许昌政治面貌:群众求学经历:2001年9月－2007年6月:就读于河南中医学院针灸推拿以及中西医结合临床专业，获得医学学士学位1.1－2010.7:于广西中医学院攻读中医内科硕士学位科研及工作情况:2006年-2007年:于许昌市中医院实习6个月；河南中医学院第三附属医院实习4个月；许昌市中医院消化内科实习2个月2007年-2010年:广西中医学院第二附属医院临床轮转实习承担或主研科研课题:广西壮族自治区卫生厅课题：安胃汤对慢性萎缩性胃炎大鼠ECG及其受体基因表达的影响51···
