外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察论文

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1、外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察论文【摘要】目的观察外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘微环境中存活状态。方法选取健康新西兰大白兔24只，体外培养经基因转染红色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞，待细胞活性状态最佳时，利用显微注射方法将其注入兔腰椎间盘，分别于术后1、7、14、30、60d手术取出椎间盘，制备病理学切片，在荧光显微镜下观察外源性骨髓间充质干细胞是否散发出红色的荧光及荧光细胞数量。结果术后1、7、14、30、60d椎间盘切片在荧光显微镜下均可观察到荧光，术后14d细胞所散发出的荧光较术后1d及7d有所减弱.freelesenchymalstemcells(

2、MSC)inmicroenvironmentofintervertebraldisc(IVD)ofrabbit.MethodsTicroinjectedintorabbitIVDovedonday1,7,14,30and60afteroperation,andapathologicalsectiondone.Tomakesureifredfluorescenceberoffluorescyte,anobservationicroscope.ResultsTheredfluorescencecouldbeseenonallIVDsections,thefluorescenceon1

3、4thdayafterinjectionorediffuseddistribution.Thenumberoffluorescytesoreon30thand60thdaythanthatonday1-14(F=15.171,P0.01).ConclusionExogenousMSCscanstillsurviveinlivingrabbitIVD60daysaftersurgery.KEYesenchymalstemcells;Intervertebraldisc;Retrogradedegeneration椎间盘退变是随着人年龄增长而出现的一种生理性退变过程，随着年龄增长椎间盘

4、在体积、形态、结构、组成及生物力学等方面不断发生变化1。椎间盘退变是引发颈肩痛、腰背痛等症状的一个重要因素。而椎间盘退变又可以继发脊柱节段性不稳、滑脱、椎管狭窄、椎间盘突出、椎间盘源性腰背痛等一系列脊柱疾患2。目前治疗方法主要是保守治疗和手术治疗，但没有一种可以从根本上逆转或延缓椎间盘退变的方法。骨髓间充质干细胞(MSCs)在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞分化的能力3，在体外经合适条件诱导可以转化为成软骨细胞4，参与软骨修复与再生。椎间盘内的髓核细胞与关节软骨细胞有很多相似的性质，那么，将MSCs置于活体椎间盘内环境之中，MSCs是否可以存活?本实验旨在观察MSCs在活体兔椎间

5、盘内的生存状态，为进一步探讨MSCs向髓核样细胞分化的趋向性奠定实验基础。1材料与方法1.1实验材料3月龄新西兰大白兔24只，雌雄不限，购自山东省农业科学院畜牧兽医研究所。经基因转染红色荧光蛋白标记的兔MSCs，购自广州CyagenBiosciences公司。1.2实验方法1.2.1MSCs的准备体外培养兔MSCs，至第三或四代细胞状态、活力最好时进行消化。在细胞培养瓶内加入由体积分数为0.0025的trypsinEDTA0.3mL+体积分数为0.003的PBS混合液消化5min，待细胞全部变为圆形漂浮，加入3mL培养液终止消化，1000r/min离心4min，弃上清，加入9g/

6、L的NaCl溶液混成细胞悬浮液后计数，调整细胞密度至1×109/L，待用。1.2.2手术注射MSCs常规术前准备，将新西兰大白兔称质量、麻醉(氯胺酮80mg/kg+地西泮5mg/kg)后左侧卧位置于手术操作台上，取腰椎后外侧入路，于右侧髂后上棘上方逐层切开，显露椎旁肌，沿其腹侧钝性分离，显露椎体及椎间盘(L23,L34,.freelm,穿破纤维环到达髓核后能够感觉明显落空感。常规关闭切口。术后给予青霉素100万单位肌注。1.2.3标本制备及观察分别于术后1、7、14、30、60d处死动物，获取L23、L34、L45、L56完整椎间盘;迅速将其置于-20℃衡冷切片机，选取

7、椎间盘最大横切面，以3μm厚度切片;切片后立即置于荧光显微镜下观察是否有荧光存在,观察不同时间段荧光细胞密度、亮度、存在部位并进行对比;显微镜(100倍)下计数每高倍视野下荧光细胞。1.3统计学处理应用SPSS13.0及PPMS1.55统计学软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。2结果2.1实验动物一般状况24只兔有3只在术后第2、3天死亡，1只并发截瘫。20只兔顺利进入实验观察，无感染等并发症。切取椎间盘后大体观察正常，纤维环完整，注射