肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究

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1、肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究周乐，和平，王艳，屈建强，王一理【摘要】　　目的探讨肿瘤间质灌注液蛋白质组作为分析肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组的可能性。方法应用PBS液孵育新鲜肿瘤组织，提取肿瘤间质灌注液中的总蛋白，并应用蛋白质组学技术对其进行分析研究。结果应用双向电泳、质谱和生物信息技术成功分离并鉴定出肿瘤间质灌注液中的蛋白成分；在肿瘤间质灌注液中发现肿瘤分泌蛋白Profilin1。结论肿瘤间质灌注液蛋白质组学研究为研究肿瘤组织中细胞微环境蛋白质组提供了新的研究方案。【关键词】肿瘤间质灌注液微环境蛋白质组　　AB

2、STRACT:ObjectiveToobservethepossibilitythattheproteomicsofthetumorinterstitialperfusingfluidcanbeanalyzedasthetumormicroenvironmentproteomics.MethodsCleanfreshtumortissuebiopsiesormicroenvironmentproteinsicstechnique.ResultsTheproteinsintumorinterstitialperfu

3、singfluidensionalgelelectrophoresis(2DE),Matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry(MALDITOFMS)andbioinformatics;oneoftheproteinsorinterstitialperfusingfluidproteomicscanbeanalyzedasthetumormicroenvironmentproteomics.　　KEYaster2DE

4、lite5.0、固定pH梯度(IPG)胶条(pH4～7L)、IPG缓冲液，银染试剂盒、图像分析软件ImageMaster5.0均购自AmershamBiosciences公司；VoyagerDEMALDITOF质谱仪购自美国ABI公司；CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、测序级的TPCK胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、αcyano4hydroxycinnamicacid(CHCA)购于Sigma公司。实验中所有用水均为milliQ水。　　1.2方法　　新鲜乳腺癌转移淋巴结癌组织在离体后迅

5、速置于冰上，20min内送至实验室进行后续实验。取大约0.25g新鲜干净肿瘤组织标本，切成直径大约1～3mm的小组织块。PBS冲洗组织表面残留血迹，37℃、0.8mLPBS湿化培养箱中孵育组织块1h；4℃下取孵育液1000r/min离心2min，取上清5000r/min再次离心20min，所得上清为肿瘤间质灌注液。　　取含80μg蛋白质的灌注液样本，加4倍体积-20℃预冷的丙酮，混匀后，-20℃静置3h，13000r/min离心10min，去上清，留沉淀室温干燥后备用。双向凝胶电泳参照ZHOU等[1]的方法进行。

6、将160μg蛋白质在13cmpH4～7L的IPG胶条上行等电聚焦电泳。聚焦完成，胶条经平衡后进行SDSPAGE第二向电泳。待2DE结束之后，对所得凝胶依次进行银染、图像扫描和分析。　　质谱分析方法为随机选择一蛋白点a依次进行胶内酶解、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)分析，获蛋白点a的肽质量指纹图谱，并应用Mascot软件在Swissprot蛋白库中对蛋白进行鉴定[2]。　　2结果　　应用双向凝胶电泳技术，在肿瘤间质灌注液中分离得到数百种蛋白质(图1)。这说明肿瘤间质灌注液含大量蛋白信

7、息。之后随机选取蛋白点a顺序进行胶内酶解以及MALDITOFMS检测，得蛋白点a肽指纹图谱(图2)。依据该肽指纹图谱在数据库中检索，首选蛋白Profilin1评74分，符合Mascot软件统计学标准(P0.05)。最终蛋白a被确认为Profilin1蛋白(图3)。　　3讨论　　肿瘤的生长和进展既依赖于肿瘤细胞的恶性程度，也依赖于肿瘤细胞与局部微环境中所有细胞(包括肿瘤细胞、体细胞、内皮细胞和免疫炎性细胞等)所产生因子的相互间作用。而这种相互作用在同一肿瘤内部可能随时间或空间的改变而改变。　　已知信息表明，肿

8、瘤细胞分泌因子可改变成纤维细胞在基质上的活性，反过来成纤维细胞分泌的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白和细胞因子可以影响肿瘤细胞的生物特性和活性。此外，体细胞分泌的蛋白酶容易促使组织降解、癌细胞移动和转移[3]。其他肿瘤微环境中的非瘤细胞类型包括内皮细胞和他们的支撑细胞(周细胞)、炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)、M细胞(ma