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1、外源性人aFGF在内皮祖细胞中的分泌论文.freelL含100mL/LFCS的DMEM培养液,37℃、50mL/LCO2,培养24h。吸出6孔板中培养液,按1mL/孔将倍比稀释的病毒液加到6孔板中,细胞在37℃培养1h后,每孔加入1mL含100mL/LFCS的DMEM。继续培养。1.2.3AAV感染内皮祖细胞将EPC分成3组,按1×105个/孔接种到6孔板中。分别用AAVspaFGF和AAVhrGFP感染EPC,未感染的EPC作为对照,标记为spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC。培养液为含50mL/L胎牛血清的EGM2,在37℃、50
2、mL/LCO2中培养24h。用PBS液洗涤细胞3次,彻底洗去血清成分。在试管中将200μLAAV浓缩液与1mL无血清的EBM2混合,加入到每孔细胞中。分别标记为“EPCspaFGF”,“EPChrGFP”和“EPC”。将细胞置于37℃、50mL/LCO2中培养2h,期间每隔15min转动1次培养板,保证病毒液与细胞充分接触。2h后用1mL含50mL/L胎牛血清的EGM2代替无血清的EBM2,置于细胞培养箱中继续培养。1.2.4检测细胞分泌的aFGF蛋白收集spaFGFEPC、hrGFPEPC、EPC3组细胞培养液,离心后,取上清液,用ELIS
3、A试剂盒检测其中的人aFGF蛋白。取样品与倍比稀释的标准品各01mL加入已包被抗人aFGF抗体的酶标板中,一孔加样品稀释液作为0孔,加盖。37℃反应120min。反应后甩去酶标板内液体,按01mL/孔加入生物素抗人FGFacidic抗体工作液,37℃反应60min。01mol/LPBS洗涤后,加入ABC工作液（TMB空白显色孔除外）,37℃反应30min。洗涤后加入TMB显色液,37℃避光反应。30min后加入TMB终止液测定A450值。1.2.5统计学分析用SPSS12.0软件包分析所得数据,比较3组细胞分泌的aFGF,P005为具有统计学
4、意义。2结果2.1AAV感染HT1080细胞将AAV感染AAVHT1080细胞,48h后,在倒置荧光显微镜下可观察到细胞发出绿色荧光（图1）。流式细胞术分析显示,GFP+细胞数约占40%。图1AAV感染AAVHT1080细胞（48h后）2.2AAV感染内皮祖细胞由于AAV载体质粒pAAVIREShrGFP中含有编码绿色荧光蛋白（hrGFP）的基因序列,通过基因克隆的方法,将spaFGF基因插入到GFP基因的上游,通过荧光显微镜可实时观察AAV的感染情况。用同样滴度的AAVspaFGF和AAVGFP分别感染EPC,在感染细胞的第4天时,转导sp
5、aFGF基因的EPC和转导GFP基因的EPC均出现绿色荧光（图2）。图2AAV感染的EPC（略）2.3检测3组EPC分泌的人aFGF蛋白转spaFGF基因的EPC分泌的aFGF水平显著高于转GFP基因EPC和未转基因EPC（862±49）ng/Lvs（115±16）ng/L,（862±49）ng/Lvs（98±10）ng/L,P005,而后两组细胞分泌的aFGF差异无统计学意义（115±16）ng/Lvs（98±10）ng/L,P005。3讨论当原先的血管不能提供充足的血流时,侧支循环成为一个重要的血液供给的来源,因此,研究促血管生长成为治疗
6、缺血性心脏病的一个新方向。从动物模型到临床试验,对于应用细胞生长因子治疗组织缺血性疾病的研究早已开展4-6,实验证实,在缺血心肌局部注射生长因子能促进侧支循环的发展7。aFGF是一种有效的促内皮细胞有丝分裂剂,可以通过促进内皮细胞的激活、迁移、增殖和血管周细胞的募集的机制促进血管生长。aFGF半衰期短,注射到体内很快被清除和降解,而基因转导可以在较长一段时期内,在组织局部维持适当浓度的生长因子水平,达到治疗效果。由于人aFGF缺少信号肽序列,不能以可溶性方式释放到细胞外,因此,在临床试验中要求对aFGF基因进行修饰,即在aFGF基因的前端加上
7、一段编码信号肽的基因序列,构成分泌型aFGF基因。重组基因表达出带有信号肽的aFGF蛋白,可分泌到细胞外,从而增强其促血管新生作用。本实验的AAV系统中,spaFGF基因被克隆在载体质粒pAAVIREShrGFP的多克隆位点中,和hrGFP（人重组绿色荧光蛋白）基因由同一个转录子翻译,所以hrGFP的表达可以被用作确定对目的细胞的感染效率和作为插入的目的基因的表达标志。重组AAV感染细胞后,当我们在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光时,提示目的基因已经导入细胞中。在用AAV感染细胞的过程中,我们发现,被同样数量的AAV感染后,不同的细胞出现绿色荧
8、光的时间不同:293细胞被感染24h后出现绿色荧光;HT1080被感染48h后出现绿色荧光;而在EPC中,至少需要72h才能出现绿色荧光。流式细胞术的检测结果反映,
