人杀菌-渗透增强蛋白n末端片段表达载体的构建

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1、人杀菌/渗透增强蛋白N末端片段表达载体的构建[摘要]目的:建立杀菌/渗透增强蛋白(BPI)N端193个氨基酸的重组表达质粒。方法:利用RTPCR的方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1～193个氨基酸的基因序列，克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组的原核表达质粒pETBPI193，转化大肠杆菌BL21菌株。结果:从HL60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段，构建了TBPI193亚克隆和PETBPI193重组表达质粒。结论:成功构建了pETBPI193重组表达质粒。　　[关键词]杀菌/渗透增加蛋白；

2、基因表达；大肠杆菌　　TheConstructionofHumanBactericidal/PermeabilityIncreasingProtEinNterminalFragmentExpressionVector　　Abstract:ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionvectorencodingfirst193aminoacidsofBPINterminal.MethodsTotalRNAHL60andthenplifiedbyusingRTPCR.ThePCRproductidedintopetent

3、E.coliBL21andproteinexpressionentplifiedbyRTPCR.BPIcDNAeabilityincreasingprotein;Geneexpression;E.coli　　感染是临床各科最常见的疾病之一。虽然近年来新型化学抗菌药物不断问世，但G菌败血症引起休克死亡的比率仍然很高，迄今尚未获得有效的解决办法，临床治疗急需要新的抗G菌感染的药物。杀菌/渗透增强蛋白（bactericidal/permeabilityincreasingprotein，BPI）是对细菌高度稳定的非催化阳离子抗菌蛋白，主要存在于人及哺乳动物中性粒

4、细胞嗜天青颗粒中,也可微量表达于中性粒细胞和单核细胞表面，还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞等中，它不仅具有特异性杀伤G菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”[1~4]。本研究拟构建BPI氨基端（BPI193）克隆入T载体以增强连接效率,并通过定向克隆的方式构建原核表达载体，为进一步研究BPI体内外的生物活性，研发新的BPI产品创造条件[5]。　　1材料和方法　　1.1细胞株、菌种和质粒HL60细胞株由第四军医大学微生物学教研室雷迎峰博士惠赠。E.coliDH5α和E.coliBL21为本室保存菌株。pMD18T载体为TaKaRa

5、公司产品。pET28a原核表达质粒为Novagen公司产品。　　1.2主要试剂Trizol为Invitrogen公司产品。cDNA第一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司。XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。DEPC为sigma公司产品。小剂量质粒提取试剂盒和DL2000DNAmarker购自北京天为时代公司。小分子量蛋白marker购自华美公司。1640培养基购自Gibco公司。　　1.3引物的设计与合成根据GeneBank数据库已收录的BPIcDNA的基因序列，借助于软件PrimerP

6、remier5.0和DNAclub设计了扩增BPI1～193个氨基酸的上下游扩增引物。　　在引物的5'端分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，以确保酶切后插入pET28a原核表达载体，并且读码框正确，还添加了起始密码ATG和终止子TAA。扩增的BPI位于124～702bp，DNA长度为579bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。　　1.4方法　　1.4.1RTPCR扩增目的基因:用trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA，按试剂盒说明反转录出cDNA第一链后PCR扩增目的基因。经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收

7、PCR产物。通过1%的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。　　1.4.2PCR产物与T载体的连接及鉴定:按照pMD18T载体说明书，进行PCR回收产物与pMD18T载体的连接反应。将连接产物转化感受态E.coliDH5α，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，用PCR、限制性内切酶分析和DNA测序证实BPI193是否插入T载体以及基因序列有无突变。　　1.4.3pETBPI193重组质粒的构建:分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切TBPI193和原核表达载体pET28a，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶回收试剂盒回收，DNA定量后在T4DNA连接酶的作用下将B

8、PI193定向克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组的原核表达