氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察

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1、氟达拉滨气道滴入对小鼠病毒性肺炎疗效观察【摘要】目的：探讨氟达拉滨气道滴入对小鼠仙台病毒性肺炎是否具有治疗作用。方法:将21只ICR小鼠随机分为对照组、仙台病毒组和仙台病毒加氟达拉滨治疗组。接种病毒和用药7d后评价各组一般状况、病理学表现，测定肺组织信号转导和转录活化因子1（signaltransductionandactivationoftranscription1，STAT1）核酸和蛋白表达水平。结果:仙台病毒经鼻滴入可引起严重的肺部炎症，肺组织STAT1mRNA和蛋白表达下降（P<0.05）。氟达拉滨治疗组虽STAT1核酸和蛋白

2、表达下降，但肺部炎症反应较仙台病毒组轻，淋巴细胞浸润程度较仙台病毒组轻（P<0.05）,动物一般情况有所改善。结论:氟达拉滨气道滴入在仙台病毒导致的小鼠病毒性肺炎中具有减轻气道炎症、抑制淋巴细胞募集和改善动物一般状况的作用。该作用与氟达拉滨抑制STAT1合成的作用无关，而可能与其抑制淋巴细胞的作用有关。【关键词】氟达拉滨仙台病毒信号转导和转录活化因子1小鼠肺部病毒性疾病种类众多，由于其发病机制还不完全明了，临床往往使用糖皮质激素对过度强烈的免疫反应进行抑制，情况如近年出现的传染性非典型性肺炎（SARS）。但长期大量使用激素的副作用明显

3、，且激素在抑制炎症方面并非总是最佳选择，因此需要其他高效、安全的药物作为激素治疗的替代和补充。信号转导和转录活化因子1（signaltransductionandactivationoftranscription1,STAT1）被认为与机体的抗病毒免疫和炎症过程密切相关，它的活化虽为抗病毒免疫必需，但过度活化的STAT1却与炎症的放大有密切关系。因此STAT1通路就成为炎症性疾病治疗的靶点之一。磷酸氟达拉滨（fludarabinephosphate，FaraAMP），又名福达华（fludara），化学名9βD阿拉伯酸呋喃糖2氟

4、腺嘌呤5磷酸盐，分子式为C10H13FN5O7P,主要用于血液系统恶性疾病如慢性淋巴细胞性白血病（CLL）的治疗，具有抑制T淋巴细胞的作用[1]。此外，新近国外研究表明氟达拉滨在体外还有抑制STAT1表达的作用，提示该药在免疫反应过度的疾病中具有潜在应用价值。本研究旨在初步探讨其在病毒性肺炎治疗中的抗炎效果及吸入治疗的可行性。1材料与方法1.1材料7周龄ICR清洁级小鼠21只，雌雄不拘，质量(22.9±1.2)g，购自江苏省实验动物中心；仙台病毒由南京医科大学免疫教研室惠赠；磷酸氟达拉滨为意大利先灵葆雅公司产品；兔抗鼠STAT1多克隆抗体

5、和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG均购自SantaCruz；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录酶MMLV和TaqDNA聚合酶为Promega产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；显微镜和图像分析软件为ZEissAxioCamMRcolor；垂直电泳及蛋白半干转印设备和凝胶扫描仪均为BioRad；BandLeader凝胶条带分析软件。1.2方法1.2.1动物分组21只小鼠随机分为3组，每组7只，为对照组（A组）、仙台病毒组（B组）和仙台病毒加氟达拉滨治疗组（C组）。1.2.2仙台病毒滴度测定和仙台病毒肺炎模型

6、的建立取新鲜鸡全血，分离红细胞。在血凝板中每孔加入0.5ml0.5%的鸡红细胞PBS悬液,共8孔。每孔再加入0.5ml仙台病毒鸡胚尿囊液，浓度从1/10到1/1280成倍递减，另设一孔为阴性对照。室温静置3060min后观察血凝结果，红细胞呈伞状在血凝板底部沉积，边缘略呈伞状翻卷为阳性，血球呈点状沉积于血凝板底部者为阴性。以阳性结果的最高稀释度为血凝效价。本实验采用的仙台病毒血凝效价为1∶320。小鼠吸入乙醚作轻度麻醉后，A组经鼻滴入50μlPBS，B、C组动物均经鼻滴入同体积仙台病毒鸡胚尿囊液制备仙台病毒肺部感染模型，C组同时滴入0.04m

7、g·ml-1的氟达拉滨PBS溶液25μl。1.2．3氟达拉滨用药方法参照我们以往实验结果，选择0.001mg·只-1为气道局部用药剂量[2]。1.2.4动物一般状况和大体病理观察每日记录小鼠体质量，观察动物一般状况。7d后将小鼠脱颈椎处死后取肺组织，将左肺上叶置10%中性福尔马林中固定行连续石蜡切片(厚4μm),常规苏木素伊红（HE）染色行病理观察；右肺中下叶同样方法固定以备免疫组织化学分析；左下叶肺组织冻存于-70℃作MLV（Promega）逆转录合成第一链。取第一链cDNA产物2μl进行后续PCR反应。STAT1上游引物序列为5′TG

8、GGAGCACGCTGCCTATGATGTC3′,下游引物序列为5′CCTTCGCTTCCACTCCACGAGCTC3′，产物大小为610bp[4]。作为内参