硒-藻蓝蛋白缀合物的制备及抗肿瘤活性研究硕士学位论文

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1、广东海洋大学硕士学位论文硒-藻蓝蛋白缀合物的制备及抗肿瘤活性研究姓名：部音利申请学位级别：硕士专业：水产品加工及贮藏工程指导教师：冯亚非20090601硒．藻蓝蛋白缀合物的制备及抗肿瘤活性研究摘要背景与目的藻蓝蛋f兰t(Phycocyanin，PC)存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中，是藻类特有的捕光色素蛋白。由于藻蓝蛋白具有对光能吸收传递的特殊性质，已被用来作为肿瘤激光治疗的光敏剂。藻蓝蛋白带有荧光，可制成荧光标记物，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中。近期的研究显示，藻蓝蛋白还具有一系列重要的生理活性，其中对肿瘤细胞的抑制作用受到关注，为了提高抗肿瘤活性，

2、富硒藻蓝蛋白的研究也同益活跃。硒是人体必需的微量元素，具有重要的生理功能和广泛的药理作用。研究发现，蛋白质能够控制红色元素硒原子的聚合，形成以蛋白为核心、硒为膜，或者以蛋白质为分散剂的硒纳米粒子。该粒子粒径20．60nm，呈红色，易溶于水，对热稳定，不会转化成灰色、黑色元素硒，并且对小鼠具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、抑制肿瘤等生物活性。藻蓝蛋白虽然具有生物活性，但普遍认为不如螺旋藻多糖显著。为了提高其生物活性，目前的研究多集中于生物富集硒，即在培养螺旋藻的环境中加入含硒物质，使硒在螺旋藻体生长过程中被利用并富集于细胞内。此种方法所得到的藻体中各部分均含有硒元素，且较难准确

3、控制藻蓝蛋白与硒的比例。本实验采用藻体外缀合的方法，将纯化后的藻蓝蛋白与一定比例的硒作用，从而得到硒．藻蓝蛋白缀合物，能够准确控制硒在缀合物中的含量，并得到单一的硒．藻蓝蛋白，纯度高，操作较为简便。藻蓝蛋白和硒都具有抗肿瘤活性，而许多硒．蛋白质复合物也都表现出一定的抑瘤作用。我们有理由假设硒．藻蓝蛋白缀合物因协同作用而使其抗肿瘤活性更强、对机体免疫系统的破坏程度更低。本实验对硒．藻蓝蛋白缀合物、藻蓝蛋白的抗肿瘤活性进行探究和对比，期望得到既有较好的抗肿瘤活性，又能够增强机体免疫力、最大限度减少对机体损害的新型活性物质。方法‘1．采用细胞破碎、盐溶、盐析等方法，从螺旋藻中提取

4、藻蓝蛋白粗品，探索高提取率、大规模提取的实验条件。2．设计双水相萃取法最佳方案，纯化PC。以紫外．可见吸收光谱、等电点聚焦电泳检沏,Opc的纯度。I3．se(Ⅳ)与Pc进行缀合作用，并对所得缀合物se—Pc进行表征(主要为紫外．可见吸收光谱和红外吸收光谱)，并与单纯PC进行比较。4．KM小鼠随机分组，检验PC、Se．PC对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。5．以CY为阳性对照组，考察PC、Se．PC各剂量组小鼠的胸腺指数、脾脏指数变化，对小鼠免疫系统的影响。结果1．ATPE法纯化PC最佳条件如下：PEG．4000(w／w)15％，KPi(w／w)16％(K2HP04与KH2P04质量

5、比为35：65)，pH=6．28，PC粗提液(w／w)10％。PC粗品经此ATPE体系纯化3次纯度可达3．83，回收率23．99％。经超滤后纯度可达到4．04。2．纯化后的藻蓝蛋白测定紫外可见吸收光谱，在278nm、360nm矛11620nm处有特征吸收峰，等电点聚焦电泳测得等电点为4．3。主要技术指标与本实验室前期研究结果基本一致，说明PC提取纯化技术成熟，结果稳定。3．Se．PC与PC的紫外．可见吸收光谱相比较，620nm处的特征吸收下降，下降幅度与作用时间、Se([V)$11PC的摩尔比正相关；278nnl和384nm处的吸收则随Se(IV)和PC摩尔比的增加和作用时

6、问的延长而增大。红外光谱图中，PC的酰胺I带为1653．2cm～，为c【螺旋，而Se．PC缀合物的酰胺I带为1647．Ocm～，属无规则卷曲。4．PC50mg／l(g／d、75mg／kg／d、100mg／kg／d给药组，抑瘤率分别为25．O％、293％、41．2％；Se—PC50mg／kg／d、75mg／kg／d、100mg／kg／d给药组，抑瘤率分别为33．6％、37．9％、40．8％。且PC、Se．PC各剂量组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均有所增加。结论1．与传统柱层析法相比，双水相萃取法纯化PC的优势明显。ATPE法操作简单，耗时短，每次处理样品量大，能够最大限度地保留P

7、C的活性，适合较大体积PC粗提液的纯化工作。2．缀合物在278nnl处吸光值的增加说明，随着缀合作用的进行，PC的空间结构发生了改变，使原来位于分子结构内部的酪氨酸和色氨酸暴露于分子表面。3．PC、Se．PC均具有一定的抗肿瘤活性，且抑瘤率均与给药量正相关，最佳抑瘤效果均出现在100m眺g给药组，PC组为41．2％，Se．PC组为40．8％。4．PC、Se．PC对小鼠免疫器官胸腺、脾脏均有一定的保护促进作用。与CY相比，虽然PC、Se．PC中低剂量组肿瘤抑制率偏低，但却有效地保护了机体免疫器官，此外，高剂量组对肿瘤