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1、大蒜硫化物调控线粒体呼吸简述-->第1章绪论1.1前言线粒体呼吸失调同一些疾病的发生密切相关[1-2],例如位居各种心脏病发病首位的急性心肌缺血。在急性心肌缺血发生时,线粒体氧利用、线粒体质子渗透和线粒体呼吸[3]发生变化,内源性ATP依赖性钾通道(KATP)关闭[4],血管平滑肌异常收缩,心肌供血不足或断流。当线粒体呼吸异常成为发病因素时,调节线粒体呼吸成为解决急性心肌缺血的有效方法,探索发现调节剂成为治疗急性心肌缺血的重要药物候选。大蒜硫化物[5-7]对线粒体呼吸具有一定的调控作用,可能成为有希望的
2、治疗急性心肌缺血候选药物。不同大蒜硫化物对线粒体呼吸的影响与心肌线粒体微环境pH值、代谢产物种类、浓度和时间相关[1,8]。由于硫化氢(Hydrogensulfide,H2S)能够舒张异常收缩血管平滑肌,具有抗急性心肌缺血效应,引发了研究者对H2S作用于急性心肌缺血调控机制的浓烈兴趣[4,9-10]。而H2S气体直接使用存在毒性不易控制[11-12]和人们心里难以接受等问题[13-15],直接应用受到阻碍,寻找安全、稳定和可控的H2S成为解决这一问题的突破口。大蒜具有浓烈的刺激气味,含有多种脂溶性和水溶
3、性硫化物,在血管内经红细胞膜内外巯基交换[8]和脱氧血红蛋白半胱氨酸残基修饰[16]可以生成H2S,为研究大蒜-大蒜硫化物-H2S-线粒体呼吸调控-KATP开放-舒张异常收缩血管平滑肌-急性心肌缺血恢复的机制[17]奠定了基础。........1.2线粒体呼吸的研究进展1.2.1线粒体呼吸链结构1857年,阿尔伯特•冯•科立克在肌肉组织细胞中观察到颗粒状物质。1898年,德国科学家卡尔•本达,借用希腊语“线mitos”和“颗粒chondros”组成“mitochond
4、rion”。线粒体属于细胞质内较大膜性细胞器,多数直径为0.5-1.0μm,长轴1.5-3.0μm,通过光学显微镜可以观察到较小颗粒状形态结构。不同种类生物体或同一种类生物体不同类型组织线粒体数量差异较大,肝脏细胞含有1000-2000个线粒体,酵母菌细胞含有大型分支线粒体,哺乳动物成熟红细胞不含有线粒体。研究表明:细胞内线粒体数量决定细胞代谢水平,线粒体越多代谢越旺盛。线粒体形状易变,可以呈哑铃型、环形、线状、颗粒状和枝装,大小不一,不均匀分布,鼠神经元线粒体和兔心线粒体透射电镜结构,见图1.1A和B
5、。线粒体直接参与三大物质代谢、电子传递、质子转移和ATP形成等人体生命基本活动过程。首先,参加三大物质代谢。蛋白质、脂肪和糖代谢的共同代谢产物乙酰CoA进入三羧酸循环[19-20]。20种人体氨基酸代谢为丙酮酸、乙酰CoA或三羧酸循环中间产物,线粒体基质是三羧酸循环细胞内分解代谢的主要部位,线粒体是大多数细胞能量转换和输出的中枢[21]。细胞基质糖酵解生成的丙酮酸和NADH[22-23],在缺氧时,丙酮酸被NADH还原成乳酸,反应生成NAD+被糖酵解重新利用;在有氧时,丙酮酸在膜转运蛋白协助下,进入线粒
6、体基质,在丙酮酸脱氢酶系催化下氧化脱羧,生成乙酰CoA[24],同时,NAD+还原成NADH。........第2章线粒体的制备2.1实验材料线粒体作为细胞内重要的膜性细胞器,在急性心肌缺血发病过程中发挥重要作用,特别体现为线粒体呼吸的变化。研究大蒜提取液、有机硫化物、元素硫和H2S对线粒体呼吸的影响,需要制备符合实验要求的线粒体。线粒体基本结构从外向内有线粒体外膜、线粒体膜间隙、线粒体内膜和线粒体基质四个重要功能部位。线粒体外膜对氧化的物质初步分解,由于线粒体外膜有孔蛋白较高通透性和线粒体内膜较低通透
7、性,线粒体膜间隙内容物组成与细胞质基质接近,含有大量反应底物、可溶性酶和辅助因子。线粒体内膜含有很多蛋白质,参与氧化磷酸化和ATP合成,线粒体嵴上有线粒体基粒,基粒中有ATP合酶,利用呼吸链产生的能量合成ATP。线粒体基质是线粒体内膜包裹的内部空间,参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等反应。研究化学物质对线粒体呼吸的影响,不但需要提供线粒体,而且要保证分离提取的线粒体结构尽可能完整,机械损害降到最低限度,满足实验需要。以甘油为例,线粒体提取液加10%(V/V)甘油,可以有效避免周围环境温度变化对蛋白
8、质活力的不利影响[119],因此,线粒体制备过程中,保持线粒体完整性十分重要,根据Rasmussen[120-121]和Bottje[122]方法,结合实际实验条件,适当调整分离提取方法,获得了符合实验要求的线粒体。.......2.2线粒体分离提取和鉴定2.2.1线粒体分离提取密度梯度法分离提取牛心线粒体,程序如下:在0-4℃低温冷冻室内,实验采用500g新鲜牛心,剪去脂肪和结缔组织,切成小块,组织搅碎机搅碎4次,放入烧杯中,按质量和体积